疫组织化学技术1

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1、第十三章免疫组织化学技术第一节免疫组织化学技术概述一、标本的处理二、抗原的保存与修复三、抗体的处理与保存四、免疫组化的结果判断五、质量控制第二节免疫荧光组织化学技术一、组织处理二、荧光抗体的标记及染色第三节酶免疫组织化学技术一、组织处理二、酶标记抗体免疫组化染色三、非标记抗体免疫酶组化染色四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物第四节亲合组织化学染色一、生物素-亲合素法二、葡萄球菌A蛋白法三、凝集素法四、链霉亲合素-生物素法第五节免疫标记电镜技术一、免疫标记电镜技术的原理二、免疫标记电镜技术的标本制备要求三、常用的免疫标记电镜技术第六节

2、免疫组织化学技术的应用一、免疫组织化学技术的临床应用二、免疫组织化学技术的拓展思考题小结免疫组织化学技术（ImmunohistochemistryTechnique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。免疫组织化学的基本过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将标记物与抗体结合形成标记抗体；4.标本的处理与制备；5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；6.观察结果。第一节免

3、疫组织化学技术概述根据标记物的性质不同分类：荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和免疫细胞化学技术免疫标记电镜技术等标本的类型组织片标本：活组织检查标本，手术切除标本细胞片标本：组织印片、铺片、培养的粘附细胞、体液、穿刺液的细胞悬液涂片一、标本的处理标本的固定良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂蛋白质抗原—乙醇或甲醇微生物

4、抗原—丙酮或三氯化碳组织切片技术冰冻切片：较好地保存组织抗原的免疫活性石蜡切片：形态保存好，可以用于回顾性研究首选，适用于不稳定的抗原是观察组织细胞结构的理想方法，有连续性。但抗原保存不如冰冻切片。二、抗原的保存与修复抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。所以，使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。常用的方法有：酶消化法盐酸水解暴露抗原法微波炉恢复抗原法高压锅恢复抗原法煮沸恢复抗原法无花果蛋白酶—轻度消化酶胰蛋白酶—中度消化酶胃蛋白酶

5、—强消化酶掌握盐酸浓度、水解温度、时间、以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原借助微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，已暴露掩盖的抗原决定簇。经济简单，适用于大批切片也是利用热效应恢复抗原性三、抗体的处理与保存抗体的选择注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低抗体的稀释抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻

6、融而使抗体效价降低四、结果判断必须设立对照对照实验：阳性对照阴性对照确证实验：空白实验替代试验吸收或阻断试验设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体。采用已知抗原阳性标本与待检标本同时进行以排除假阳性用缓冲液代替第一抗体，以排除组织细胞内所含的生物素或内源性酶。直接法常采用。用与待测抗原同一种动物免疫前血清或非免疫血清代替第一抗体已确认阳性反应不是异嗜性抗原所致非特异性反应。直接法和间接法均可采用先用已知过量抗原与第一抗体反应，离心后再进行组化染色，此时的阳性标本应呈阴性，其目的在于确认阳性反应是与天然抗原相同的抗

7、原抗体反应，间接法常采用。阳性细胞显色分布类型细胞质细胞核细胞膜表面阳性细胞显色：抗原分布于细胞核阳性显色深浅反映抗原存在的数量，可以作为定性的依据定位的依据定量的依据阳性细胞呈散在分布阳性细胞分布分为散在分布灶性分布弥散分布阳性细胞呈灶性分布阴性结果和抗原不表达阴性结果:不能简单认为具有否定意义，阳性表达有强弱、多少之分，只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。特异性染色与非特异性染色特异性染色非特异性染色分布在特定的部位,具结构性（如细胞质、细胞核、或细胞表面）无分布规律，常出现

8、在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着