疫组织化学的基本理论与技术

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1、第二章免疫组织化学的基本理论与技术一、免疫组织化学的基本理论1原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。2免疫组织化学全过程包括:⑴抗原提取⑵抗体制备(博士

2、德,华美,基因公司等购买)⑶抗体标记⑷免疫染色⑸观察分析等过程二、抗原与抗体1.抗原Ag定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。蛋白质：免疫原性最强；多糖：免疫原性次之；脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。2.抗体Ab定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。存在部位：主要存在于血清内。分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，即IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。根据制备方法不同分为两种即单克隆抗体与多克隆抗体IgG的结构I

3、gG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。浆细胞AbAb浆细胞BBAgBB浆细胞浆细胞AbAb多克隆抗体制备原理：将纯化的抗原注射入动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。单克隆抗体Ag合成抗体效应性B细胞(浆细胞)不能在体外生长瑞士Kohler英国Milstein多发性骨髓瘤细胞多发性骨髓瘤细胞不能合成抗体能

4、在体外大量繁殖BB浆细胞浆细胞脾多发性骨髓瘤细胞AbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAb一抗单克隆抗体多克隆抗体缺点:价格较高，容易出现假阴性反应。实质:是受同一种抗原刺激，由多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。优点:容易制备，价格便宜缺点:可能与多种特异性和非特异性的抗原决定簇反应，出现非特异性染色，影响结果的判定。实质:是受同一种抗原刺激，由单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。优点:特异性强，敏感性高，抗体产量高。首选三、免疫组织化学的基本技术免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗原(或抗体)检测组织和细胞内的抗原，

5、从而达到诊断或研究的目的。特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准确与细胞和组织标本制各的质量好坏有着密切关系。因此，组织和细胞标本的取材和制备至关重要。1.组织标本制备（1）标本新鲜：一般在2h以内进行。（2）取材部位：取含待检抗原部位，还应取病灶与正常交界处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开坏死区。（3）避免挤压：剪刀、刀片的刃口要锋利。（4）取材大小：做石蜡切片的组织厚度不宜超过2mm，用作冰冻切片的以4mm为宜。（5）固定:化学固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。2．细胞

6、标本制备(1)印片法应用：活检标本、手术切除的标本。方法：将新鲜标本暴露病区,用载玻片轻压病区，脱落细胞粘附于载玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低温保存。优点：简便省时，细胞抗原保存较好。缺点：细胞分布不均、重叠,影响观察效果(2)穿刺吸取涂片法应用：实质器官的病变区。方法：①穿刺液较少时直接涂片,力求均匀。②穿刺液较多时，穿刺液滴入2毫升Hanks液内，离心，制成细胞悬液，吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。优点：细胞均匀。缺点：细胞易变形。(3)体液沉淀涂片法1)细胞数较多，取一滴直接涂片。2)细胞数较少时，取5毫升自

7、然沉淀液以1500rpm离心10min，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。（4）体外培养细胞1)贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。2)悬浮生长的细胞：可用离心涂片机法制成涂片。（5）离心涂片机法制成2×105-6／ml细胞悬液,取50～100μl，加入涂片机内，1000r／min,2min，细胞即可均匀分布于载玻片上。（二）免疫组织化学的固定方法免疫组织化学固定的原则：最好地保存细胞和组织的形态结构和最大限度地保存抗原的免疫活性。方法：一）固定有物理固定，如血涂片可采用空气快速干燥、冻结干燥等；二）化学固定1．浸入

8、法：组织立即浸于固定液内,时间在2～12h之间。2．灌注法：插管由左心室插入主动脉,先用PBS冲洗血液,再以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后