重组DNA技术与蛋白质工程

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1、基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第一节重组DNA技术DNARecombinationTechnique一、相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体二、基本原理及操作步骤本节主要内容一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通

2、过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的①分离获得某一目的基因或DNA②获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特

3、异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´

4、羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（基因工程技术中常用的是Ⅱ类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophil

5、usinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点：——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATC

6、TAGGATCTADNA聚合酶和DNA连接酶DNA连接酶催化5’和3’端形成磷酸二酯键，底物为带缺口的DNA、黏端DNA或平端DNA。GGATCTCCTAGAGCCTAGGATCTA+BamHⅠ（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)：为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA基因组DNA(genomicDNA)（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计

7、的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准含有复制起始点，能在宿主中独立复制；分子量小，以容纳较大的外源DNA；不能插入宿主基因组，易于分离和纯化；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），由限制性内切酶的识别序列组成。1.质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状（一般带有抗生素的抗性基因）。细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。λ噬菌

8、体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)：适用于大片段DNA的克隆M13噬菌体DNA改造系统（含lac