DNA的复制、修复与重组DNA技术

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1、第十二章DNA的复制、修复与重组转录翻译复制遗传信息的传递遗传信息的表达分子生物学中心法则(centraldogma)1958年Crick1970年Temin和BaltimoreDNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制第一节DNA复制的原则半保留复制(semiconservativereplication)半不连续复制(semi-discontimuousreplication)RNA引物复制起始点和复制方向一、半保留复制定义：亲代DNA分子的两条链可以分别作为模板，按碱基互补配对原则，指导DNA新链的合成。新合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代DNA

2、分子完全一样，但一条链来自亲代DNA链，另一条链是新合成的DNA链。二、半不连续复制5`3`3`5`3`5`5`5`3`3`5`3`3`5`定义：DNA复制时，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制，称半不连续复制。前导链(leadingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向连续不断地合成的DNA链。随从链(laggingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向不连续合成的DNA链。冈崎片段（Okazakifragment）：后随链上不连续合成的1000～2000或100～200个核苷酸组成的DNA小片段。三、RNA引物定义：DNA复制时，子链5

3、`端的一段寡聚核糖核苷酸链，能为DNA聚合酶提供聚合新的脱氧核糖核苷酸所需的3`OH，最后可被切除。意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的3`OH保证复制起始部位的真实性3`5`DNA模板3`5`DNA模板RNA引物5`OH-3`RNA引物5`OH-3`3`引物酶（RNA聚合酶）第二节参与DNA复制的一些酶类和蛋白质一、原核生物大肠埃希菌的DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ（Kornberg酶）发现:1955年Arshur.Kornberg（阿瑟.康恩伯格）1959年诺贝尔生理和医学奖活性:大片段5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性小片段5`→3`外切酶活性

4、5`→3`外切5`→3`聚合3`→5`外切N`C`大片段Klenow片段小片段罗杰.科恩伯格接受父亲（左）的祝贺TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.Kornberg罗杰.科恩伯格5`→3`外切酶活性功能：切除RNA引物切除突变片段，在DNA损伤修复中起作用5`→3`聚合酶活性功能：填补片段切除后的空缺3`→5`外切酶活性T　　Ｇ　　Ｃ　　Ａ　　Ｃ　　Ａ　　Ｔ　　ＡＡ　　Ｃ　　Ｇ　　Ｔ　　Ｇ　　Ｔ　　Ａ　　Ｃ5`

5、3`5`3`T功能：校读功能（proofreading）意义：保证DNA复制的高度真实性DNA聚合酶Ⅰ多功能酶Klenow片段常用的工具酶5`3`3`5`2、DNA聚合酶Ⅱ活性：5`→3`聚合酶活性3`→5`外切酶活性功能：不确切3、DNA聚合酶Ⅲ组成：多亚基复和物全酶核心酶（αεθ）×2连接二聚体（τ2）单个运载夹钳复合物（γ2δδ`χψ）β4ααττεεθθδδ`γ2ψχββββ功能：α亚基—5`→3`聚合ε亚基—3`→5`外切τ亚基—连接γ2δδ`χψ亚基复合物—钳夹β亚基—钳夹、滑动特点：高续进性（≥50万个脱氧核糖核苷酸）高效性（≈1000个脱氧核糖

6、核苷酸/秒）高保真实性（校读功能）二、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε五种功能：DNA聚合酶α—聚合随从链DNA聚合酶δ—聚合前导链（协同增殖细胞核抗原PCNA）DNA聚合酶γ—聚合线粒体DNADNA聚合酶β、ε—校读功能、参与DNA损伤修复三、解链、解旋酶类和蛋白质（大肠杆菌E.coli）1、DNA解链酶功能：解开DNA双链条件：需要ATP供能，2个ATP/对碱基2、单链DNA结合蛋白功能：维持模板单链状态保护模板不受核酸酶水解DNA拓扑异构酶Ⅰ功能：暂时切断双链中的一股，另一股链旋转通过该缺口，张力下降后，再连接缺口DNA拓

7、扑异构酶Ⅱ功能：暂时切断双链中的两股，断端旋转，张力下降后，再连接缺口条件：需要ATP供能3、DNA拓扑异构酶4、引发体组分：DnaA辨认并结合至复制起始部位DnaB解链酶作用DnaC帮助DnaB结合至复制起始部位引物酶RNA聚合酶，合成RNA引物5、连接酶功能：催化两段DNA链间形成3`5`磷酸二酯键特点：只能催化双链DNA链上的一股或两股链的连接5`5`3`3`5`5`3`3`3`5`5`5`5`5`3`3`3`3`第三节DNA复制过程（大肠埃希菌）模板：单链DNA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶

8、辅助因子：Mg2＋其它：酶和蛋白因子方