大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定

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1、噬菌体的分离纯化及效价的测定1目的1.1了解噬菌体效价的含义及其测定原理。1.2学会检查噬菌体的方法。1.3掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。2原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重

2、要作用。检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速

3、，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。3材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏

4、蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。3.3仪器和器具无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒温水浴锅，离心机等。4流程4.1噬菌体的分离纯化鉴定4.2噬菌体效价的测定5方法5.1噬菌体的检查5.1.1样品采集将2～3g土样或5mL水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。5.1.2增殖培养30℃振荡培养12～18h,使噬菌体增殖。5.1.3噬菌体的分离（1）

5、制备菌悬液取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。（2）增殖培养于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml，37℃培养12～24小时。（3）制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15分钟。将以灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵（如图2）。图上的真空表接或不接均可。将离心上清夜倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内，37℃培养过夜，以作无菌检查。（4）确证试验经无菌检查没有细菌生长的滤

6、液作进一步证明噬菌体的存在。（a）于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。(b)待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，里37℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。噬菌体的纯化（1）如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1毫升大肠杆菌悬液，使混合均匀。(2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2毫升，立即混匀。(3）并立即倒人底

7、层培养基上，混匀。置37℃培养12小时。(4）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃培养。（5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。（以上（1)(2)(3）三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌实验的同时，由教师先做顶备试脸，若平板上的噬菌体连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做）。5.

8、1.4生物测定法5.1.4.1双层琼脂平板法5.1.4.1.1倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。5.1.4.1.2倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养