药品微生物常用鉴定方法

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1、药品微生物常用鉴定技术四川省食品药品检验检测院2016年10月成都实验助手APP授权发布一、微生物纯培养分离技术二、革兰氏染色三、微生物鉴定原则四、常用微生物鉴定技术一、微生物纯培养分离技术纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体获得纯培养物对微生物学研究至关重要微生物纯培养分离技术1、平板涂布法2、平板划线法3、平板倾注法4、稀释摇管法5、液体培养基分离法6、单细胞（孢子）分离法7、选择培养基分离法1、平板涂布法1、少量样品加到平板中央；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。2、平板划

2、线法•斜线法•曲线法•方格法•放射法•四格法平板划线法曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。3、平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。4、稀释摇管法•适合厌氧菌的纯培养分离

3、无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右梯度稀释后的待分离菌株加入试管中摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物培养后，菌落形成在琼脂柱的中间5、液体培养基分离液体培养基不能在固体培养基上生长的菌悬液微生物连续稀释在同一个稀释度的许多平行培养容器中仅含1个菌体试管中，大多数（一般应超单个菌体过95%）表现为不生长。纯培养物6、单细胞（孢子）分离法单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或个体进行培养以获得纯培养较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪单细胞分离法对操作技术有

4、比较高的要求7、选择培养基分离•选择培养基特性•促生长能力•抑制能力•指示能力二、革兰氏染色法细菌学中广泛使用1884年由丹麦医师、细菌学家汉斯·克里斯蒂安·约阿希姆·革兰氏(HansChristianJoachimGram,1853-1938)创立1、染色步骤初染媒染脱色复染2、具体操作1）涂片、固定2）草酸铵结晶紫染1分钟，水洗3）碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗4）95%酒精脱色30秒，水洗，吸去水分5）蕃红复染30秒，水洗，干燥，镜检3、原理G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

5、Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。革兰氏染色原理4、影响因素1）涂片太厚2）固定3）脱色时间4）革兰氏染液5）细菌培养时间-对数生长期6）培养基7）碘液放置时间太长8）结晶紫的浓度太高9）酒精浓度5、仪器6、实验室常用菌革兰氏染色结果三、微生物鉴定原则菌种鉴定:它是什么菌？（未知菌）1、微生物分类•分类等级细菌真核生物古菌•界（Domain）•门（Phylum）•纲（Class）•目（Order）•科（Family）•属（Genus）•种（Species）三界系统“

6、种”：微生物基本分类单元“种”的定义：一个种（基因型种）是有相似G+C组成并通过DNA杂交试验判断有70%或更大相似性的菌株的集合。种的鉴定：确定新的分离物属于已知分类单元“种”的过程。2、微生物鉴定原则3、用于微生物鉴定的特征形态学特征特征微生物类群菌体形状所有主要类群菌体大小所有主要类群菌落形态所有主要类群超微结构特征所有主要类群染色行为细菌、一些真菌纤毛和鞭毛所有主要类群运动机制滑行细菌，螺旋体内生孢子形状和位置形成内生孢子细菌孢子形态和位置细菌、藻类、真菌细胞内含物所有主要类群颜色所有主要类群生理生化特征碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源与氧的关系发酵产物最适

7、pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物糖、醇发酵试验淀粉水解试验V-P试验甲基红试验明胶液化试验尿酶试验氧化酶试验过氧化氢酶试验(触酶试验)精氨酸脱羧基酶试验...4、基因型鉴定技术•G+C%•16SrRNA分型•DNA序列测定四、常用微生物鉴定技术1、革兰氏染色2、细菌鉴定流程3、常用鉴定技术1、革兰氏染色2、细菌鉴定流程3、常用微生物鉴定技术分子生物学16SrRNA分型传统生化DNA序列测定营养物质代谢光谱质谱碳源氮源利用傅