药品微生物控制菌检查及菌种鉴定基因分型方法的研究

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1、授予单位代码10089学号或申请号13915HebeiMedicalUniversity硕士学位论文在职科学学位药品微生物控制菌检查及菌种鉴定/基因分型方法的研究学位申请人：张翠所导师：冯丽主任药师专业：药物分析学二级学院：河北省药品检验研究院2015年3月、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文,第一署名为单

2、位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名导师签章：二级学院领导盖章:1>v年6月§曰河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：导师签章：年6月孑曰目录中文摘要…………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………

3、……………….4研究论文药品微生物控制菌检查及菌种鉴定/基因分型方法的研究前言………………………………………………………………8材料与方法……………………………………………………………9结果………………………………………………………………14附图………………………………………………………………22附表………………………………………………………………47结论………………………………………………………………50参考文献………………………………………………………………51综述药品铜绿假单胞菌检查及分型方法的研究进展…………

4、……..52致谢…………………………………………………………………………64个人简历……………………………………………………………………65中文摘要药品微生物控制菌检查及菌种鉴定/基因分型方法的研究摘要在科学技术日新月异的今天，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验的微生物新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。但是在药品检验领域，微生物鉴定技术甚少。菌株随着环境的变迁不断发生着遗传变异，许多

5、控制菌株在按照标准检验时，周期长，有时出现假阴性。目前，中国药典逐渐与欧洲药典、美国药典和日本药局方协调一致，在控制菌鉴定方面也做出了“适宜的鉴定方法确证”的要求。因此，获得适宜的控制菌检查和鉴定技术是检验结果高效、准确和可靠的基本保证。铜绿假单胞菌，是临床常见重要条件致病菌之一，也是药典收载的局部用药的重要控制菌，有较高的死亡率。其易定植、易变异和多耐药，广泛存在于土壤、水、空气及人体皮肤、呼吸道与肠道。目前，该菌是药品、化妆品以及实验动物检验中一项重要的微生物控制指标。对于正常样品来讲，一般需经过灭菌处理，残存菌

6、株都或多或少受过不同程度的损伤，要通过某些培养基复苏到能够被检出的程度，势必需要满足灵敏度高、起始增菌时间短、增菌浓度高的要求。虽然药典明确提出了培养基适用性检查的必要，但是来源不同的培养基，即使满足了中国药典或其它标准的基本要求，其灵敏度也有一定差异。由于检测仪器的限制，要获得较多的实验数据，检验工作极其繁琐，是该类微生物实验进行的一个瓶颈问题。传统鉴别方法日益暴露出种种弊端，越来越不适应消费者快餐式的现代消费理念。在追求快速、简便检测的同时，更希望结果的准确性。本课题以铜绿假单胞菌为典型代表，选择不同来源的9株阳

7、性菌株和国内外16种培养基利用酶标仪在线检测OD值绘制生长曲线的方式，重点探索最适宜的液体增菌培养基和培养条件，大大减少了工作量，走在了增菌培养基筛选技术的前沿。同时对上述9株阳性菌株生化鉴定及分型方法做了进一步的探索实验。目的：采用择优录取的方式，在一定培养条件下，评选出优质、高灵1中文摘要敏度的液体增菌培养基；采用传统鉴定方法、国际金标准鉴定技术、荧光检测和基因分型，从而在最直接、最经济的鉴定与基因分型方法检验过程中发现隐含的漏检因素，为药品、化妆品以及实验动物检验提供参考。方法：液体增菌培养基和培养条件的筛选，

8、通过对生长曲线图中关键参数和绿脓菌素的浓度、菌膜生长情况对比情况，择优录取。将新鲜菌株进行传统方法鉴定、API试剂条鉴定、VITEK2compact型全自动微生物分析系统鉴定、血清分型、荧光定量PCR鉴定、RAPD基因分型。结果：TSB培养基是最符合质量要求的一种液体培养基，并且国内外各生产单位提供的产品质量差异很小。在35℃培养条件下最适宜的