western 出错原因

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1、成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．看看各部分出问题的几率，为还没有成功，仍然苦苦寻找结果的战友提供点参考（由于本人经验有限，不足之处还请斑竹和各位大侠改正）：1、蛋白提取问题，蛋白降解，或者上样量少导致检测失败。2、蛋白电泳失败。3、转膜问题：转膜不充分，过转，温度过高导致蛋白结构改变等。4、抗体问题。5、显影问题。6、其它。请战友提供各部分问题的主要说明和对策，谢谢！祝蛋白版越来越旺！大家来讨论，加分从优！抗体问题排在第一，抗体的特异性，一抗二抗的比例，这些都需要摸

2、索条件。蛋白电泳第二，胶的配置，由于APS的失效，tris-HclPH不准，丙烯酰胺的氧化（以上问题一般都是配置时间较久以后）导致电泳失败或泳道奇形怪状。我认为westernbloting中蛋白提取是关键，最好用试剂盒提取，尤其目的蛋白是在亚细胞器表达的蛋白；其次是一抗二抗，一抗最好单克隆抗体，二抗国产好厂家的也行；ECL发光试剂一定要灵敏；制胶，电泳和转膜个实验室都做得比较常规了；显影定影按说明书作做活实验是经验就行。jiangyuqing123wrote:大家来讨论，加分从优！偶不懂,特来支持,

3、我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100p

4、g），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。当然也包括多来学习~~：〉谢谢ryochan＼renbo662008＼vagabondbond＼gunzi战友参与！大家继续！我也要做，但是不知道如何下手，那位能给一个详细的方法介绍我以前做的时候问题主要出现在样品的制备上，也就是如果免疫时用到的蛋

5、白和wb时的蛋白有出入，这样就会导致wb失败，所以后来我就一次性制备足够的蛋白，可以不是很纯，但是一定要和免疫动物时候用的蛋白是同一批的。看到好几位战友都对蛋白制备有深刻的印象，也提醒我们正在WESTERN和准备WESTERN的战友，一定要注意过第一关，提出高质量的蛋白对实验成功至关重要！希望更多的战友参与！楼上几位战友提出的蛋白制备确实非常重要，但如果在裂解液中加入cocktail的话应该不容易降解，-80度保存几个月都没有问题。我认为westernblotting中最关键的一步是转膜。我的经验是

6、小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。抗体一般在其他问题排除后再考虑是否有质量问题。请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是

7、什么原因？谢谢了！softwangwrote:请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？谢谢了！softwang战友，内参一般比较好做，能出来说明整个WB的流程应该没有问题，提的蛋白也可以，但是目的蛋白由于分子量大小不一样可能电泳和转膜条件也不一样，还有蛋白丰度问题导致蛋白量低出检测范围、抗体等环节都应该考虑。具体的问题可以

8、把你详细的条件另辟新贴求助，祝出结果！谢谢！细节地方一定要多注意，比如SDS－PAGE时的缓冲液pH值啊，temed、ap的新鲜程度啊，样品上样前的处理啊，还有转膜时的电压/电流、膜的处理，还有ECL时的抗体孵育时的时间与温度，显影/定影啊等等。其实一般出问题很多时候都是由于在细节地方的疏忽造成的。希望高手继续补充细节内容：）我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳