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1、DpnI识别位点在不同反应缓冲液的活性NEBuffer1.1:100%NEBuffer2.1:100%NEBuffer3.1:75%CutSmartBuffer:100%来源重组E.coli菌株，包含有从DiplococcuspneumoniaeG41(S.Lacks)克隆的DpnI基因。特性CutSmart、重组酶、省时酶。连接和再切经过DpnI20倍过量消化，大约25%的DNA片段能被连接，连接片段中>95%能被再切。反应条件CutSmart缓冲液，37℃。热失活：80℃20分钟。浓度20,000units
2、/ml。【通过pBR322DNA（dam甲基化后）鉴定】。甲基化敏感性只有当识别位点被甲基化时，DpnI才能切割。从dam+菌株纯化而来的DNA才是DpnI切割的底物。对哺乳动物基因组DNACpG甲基化敏感。NcoI识别位点在不同反应缓冲液的活性NEBuffer1.1:100%NEBuffer2.1:100%NEBuffer3.1:100%CutSmartBuffer:100%特性重组酶、省时酶。反应条件NEBuffer3.1，37℃。热失活：80℃20分钟。浓度10,000和50,000units/ml。甲基
3、化敏感性对dam、dcm和哺乳动物CpG甲基化均不敏感。NotI识别位点在不同反应缓冲液的活性NEBuffer1.1:<10%NEBuffer2.1:50%NEBuffer3.1:100%CutSmartBuffer:25%特性重组酶、省时酶。反应条件NEBuffer3.1，37℃。热失活：65℃20分钟。浓度10,000和50,000units/ml。甲基化敏感性对哺乳动物基因组DNACpG甲基化敏感。注意事项彻底消化超螺旋质粒需要的NotI酶量为消化线性DNA的5倍。T4DNA连接酶特性■高效连接粘性末端和
4、平末端■T/A克隆■dsDNA切刻修复■构建高丰度克隆文库■RNA和DNA的连接概述该酶催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平齐末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切刻。来源纯化自E.coliC600pcl857pPLc28lig8。反应条件1XT4DNA连接酶反应缓冲液[50mMTris-HCl（pH7.5@25℃），10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP]。推荐DNA5´末端浓度为0.1-1.
5、0μM，16℃温育。热失活：65℃10分钟。室温连接反应为方便起见，连接反应可以在室温（20-25℃）条件下进行。粘性末端连接：在20μl反应体系中加入1μlT4DNA连接酶，反应10分钟。平齐末端连接：在20μl反应体系中加入1μlT4DNA连接酶反应2小时，或者加入1μl高浓度T4DNA连接酶反应10分钟。另外，NEB快速连接试剂盒[NEB#M2200S（30次反应），或NEB#M2200L（150次反应）]可在室温下5分钟内完成平齐和粘性末端的连接。单位定义（粘性末端活性单位）1单位指在20μl1XT4D
6、NA连接酶反应缓冲液中，16℃反应条件下，30分钟能使50%的经HindⅢ消化的λDNA片段[5´端浓度为0.12μM（300μg/ml）]连接所需的酶量。浓度400,000units/ml和2,000,000units/ml。注意事项与E.coliDNA连接酶需要NAD+作辅因子不同，T4DNA连接酶的辅因子是ATP。稀释后的T4DNA连接酶应于-20℃、50%甘油贮存缓冲液（稀释缓冲液A，NEB#B8001）中保存。如稀释后马上使用，也可用1XT4DNA连接酶反应缓冲液稀释。只要在反应体系中补加1mMATP
7、，连接反应就可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液或在T4DNA多聚核苷酸激酶反应缓冲液中进行。参考文献(1)Engler,M.J.andRichardson,C.C.(1982).InP.D.Boyer(Ed.),TheEnzymes,Vol.5,(p.3).SanDiego:AcademicPress.(2)Remaut,E.,Tsao,H.andFiers,W.,(1983)Gene,22,103–113.(3)Sambrook,J.etal.(1989).MolecularCloning:ALabor
8、atoryManual,(2nded.),(pp.1.53–1.73).ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratoryPress.
