摇瓶种子的制备及菌种的保藏

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1、主题二摇瓶种子的制备及菌种的保藏带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置第三节摇瓶种子的制备将斜面种子或米孢子接种入装在锥形摇瓶(又称三角摇瓶)内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子，就叫做摇瓶种子。摇瓶种子可以在摇瓶中传代，第一代俗称“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。母瓶或子瓶可用于生产上种子罐的接种，也常常作为摇瓶发酵试验的种子。1.摇瓶种子的制备工艺(1)工艺流程摇瓶种子的制备流程如图5—l所示。斜面种子或米孢子培养基配制分装灭菌接种恒温振荡培养摇瓶种子图5—1摇瓶种子制备的工艺流程（2）培养基配制摇瓶种子以培养具有强生长活性的营

2、养菌体为目的，因而在配制培养基时必须全面、均衡地满足菌体生长对各种营养物质的要求，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，故在培养基成分的选择时还应考虑培养过程中pH的稳定，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙之类缓冲剂来实现。分装培养基的三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高压蒸汽锅内灭菌。灭菌结束后要缓慢降压，以免培养基暴沸冲湿塞子。(3)接种摇瓶种子的接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数接人法。这种接种法难于掌握一致的接种量，可能影响摇瓶种子质量的稳定。对接种量敏感的菌种，最好采用悬液接种

3、法，即用无茵蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或抱子悬液，然后按一定体积或一定细胞(孢子)数接种至摇瓶种子培养基中。(4)培养摇瓶种子在恒温室内的摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式两种。抗生素工厂常用的是旋转式。这种摇床由于主动轴和从动轴之间有一个偏心距(一般为25～50mm)，从向而旋转中产生振荡作用，以利于培养时气体交换。为了使摇瓶中的水分蒸发量保持稳定，恒温室也应控制一定的湿度。(5)保存摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果暂时不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不超过3d。经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，可用于

4、摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。2．摇瓶种子的质量标准摇瓶种子是液体培养的种子，在质量的控制方面，除了保证不污染杂菌及生产能力高这类与固体培养种子相同的一般标准外，还有其特殊标准。(1)菌体浓度(2)菌体生长阶段(1)菌体浓度摇瓶种子以培养强生命力的营养菌体为目的，因而优良的摇瓶种子，首先要有一定的活菌体量。在一定的体积接种之下，活菌量越多，意味着至下一级种子的接种量越大，下一级种子的生长就越快，生长质量一般也越好。菌体浓度也不能太高，否则将影响摇瓶中的混合和气体交换，降低菌体生长质量。（2）菌体生长阶段为了使摇瓶种子有较强的生长活力，同时又满足上述

5、达到较高菌体浓度的要求，应将摇瓶种子的菌体生长阶段控制在对数生长的后期。这一菌体生长阶段，本应由测得的菌体浓度变化曲线来确定，但摇瓶系统取样监测不现实，且测量结果滞后，通常只凭在一定培养时间内外观稠度的观察、静置沉降量或离心湿菌体积的测定以及显微镜检查的结果进行判断。3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制影响斜面种子质量的各种因素一般也影响摇瓶种子的质量。除此以外，还有以下一些因素必须予以注意。（1）培养基组成（2）摇瓶装量（3）摇床转速（4）摇瓶在摇床中的位置（1）培养基组成培养基组成应能均衡地满足营养菌体生长对所有营养成分的需要。在这一前提下，培养

6、基组成越丰富，所能获得的菌体浓度就越高。如果由于某一必需营养成分不足而打破了这种均衡，那么其它营养成分的丰富不仅不能促进菌体的生长，反而因代谢的失衡引起pH的波动或(和)毒性中间代谢产物的积累，而降低菌体浓度。（2）摇瓶装量摇瓶装量影响摇瓶内的通气效果；装量越小，通气效果越好。对摇瓶种子培养最合适的装量，随抗生素产生菌耗氧特性和摇床转速而异，应当通过实验来确定。一般情况下，250、500mL和750mL摇瓶的装量分别为40～50、60～80mL和80～100mL，基本上可以满足各种抗生素摇瓶种子培养的要求。（3）摇床转速摇床转速越高，偏心距越大，摇

7、瓶内的气体交换速度就越快。我国设计的摇床，一般偏心距为25mm，转速为200～300r／min。但在使用中应经常检查传动皮带的松紧，皮带过松将使转速显著下降，从而影响摇瓶通气效果的摇瓶种子的培养。（4）摇瓶在摇床中的位置由于代谢热和机械振荡热的生成，摇床瓶内的温度必然高于摇床室室温。在摇床的不同位置，这种温差存在明显的差异。摇床上层的温度高于下层，中间的温度高于边缘。由于这种差异，使在不同位置上培养的摇瓶种子呈现不同的菌体生长浓度和生长阶段，造成种子质量的波动。为了避免这种波动，摇瓶种子的培养最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。4．孢子接入量

8、对于丝状菌来说，孢子接入量对摇瓶种子的质量及其后的抗生素生产有很大的影响。接入孢子量过少，延缓种子的生长及发酵前期的产物合