菌种保藏冷冻干燥管的制备

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1、菌种保藏冷冻干燥管的制备河北科技大学生物科学与工程学院河北省发酵工程技术研究中心徐亲民2水分在冰冻状态下直接升华而干燥冷冻干燥的三要素：真空——降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发冷冻——使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷,加速干燥温度——达到进一步加速干燥的目的冷冻干燥的优点：对微生物的生物活性影响小所得干粉疏松，溶解性好水分含量低由于同时满足干燥和真空两个菌保要素,因而保存时间长,保存过程不易失活和退化冷冻干燥原理3取质地均匀、厚实(壁厚1mm)、无毛点、无气泡的硬质玻璃专用菌种冷冻管（图1），清洗干净后在管内放置打印有菌种简略名称和编号的纸条标签（图1左边的单管式冷冻管置于熔封区

2、和装液区之间，右边的套管式冷冻管置于内外管之间），单管式冷冻管管口和套管式冷冻管内管管口插入缠绕松弛的棉签，用牛皮纸包裹，于121℃灭菌30分钟，取出置37℃孵育24小时，重复灭菌一次，105~110℃烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到深蓝色），置干燥器内备用。冷冻管的准备4图1用于冷冻干燥菌种的两种冷冻干燥管推荐尺寸：(左)Φ8×100，璧厚1mm，球径12mm；(中、右)外管Φ12×100，璧厚0.8-1mm；内管Φ9×50，壁厚0.5mm。棉塞熔封区放标签处装液区外管熔封区棉塞内管放标签处变色硅胶棉塞5取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶200g，在5000r/min下

3、离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在110℃下灭菌15分钟，冷却后备用。如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。或将脱脂奶粉制成还原乳，同上灭菌后使用。脱脂牛奶的准备6选生长饱满且无菌检查合格的新鲜菌种斜面或米孢子，加入适量灭菌脱脂牛奶(一般每支中试管斜面加10ml脱脂牛奶，或每10ml脱脂牛奶中加1g米孢子粒)，用自制接种耳(图2)将斜面上的菌苔轻轻刮下(注意不要刮坏琼脂表面)，或在强力振荡器上将米孢子粒上的孢子震落，摇匀，用灭菌吸管或长

4、针注射器吸出牛奶菌悬液，置于预先灭菌的空试管内。以上操作应在无菌室内的超净工作台上进行。菌悬液的制备7图2自制接种耳和长嘴毛滴管不锈钢丝木柄玻璃毛滴管橡皮头8将牛奶菌悬液用长针注射器或长嘴毛滴管(图2)分装入灭菌冷冻管内(注意不要使牛奶玷污纸条标签)，视冷冻管的大小每只0.3~0.5ml(单管式冷冻管球形装液区内的装液量应为球体积的一半左右，套管式冷冻管内管的装液高度与管直径相当)，取出棉签棒，留置棉花，置于冷冻干燥机内冷冻干燥24小时左右。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上再开泵。根据设备情况，有的在冷冻干燥前还要先用液氮或干冰对菌悬液进行预冻。另外，要根据冷冻干燥机的水

5、分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。冷冻干燥9确认菌悬液是否已经干燥的方法是一看真空度，二看冷冻室温度。当水分已经蒸发完，即水蒸汽分压接近零时，真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度将会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态，当没有水分的继续蒸发后，冷冻室不再吸热，温度开始自然上升。确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀，让真空释放，然后停泵，打开冷冻室，将冷冻干燥管取出。为了确保冷冻干燥管内的菌粉不被污染，在冷冻室进气口应装有空气过滤器。干燥的确认和停机10用自制简易冷冻干燥机进行冷冻干燥管的冷冻干燥，效果优于外购冷冻干燥机。制作

6、方法如下：自制两只1升左右的不锈钢缸子，一只作为真空冷冻干燥室，另一只作为冷凝室，在两个缸子的齐口处焊接宽边不锈钢圈，上面有一只能连接真空泵的加厚透明有机玻璃盖(便于观察内部)，用硅橡胶圈使缸子与缸盖密封。另外买一只2~3升的不锈钢真空保温桶，作为液氮罐(最好是专用液氮罐)，其口径应能使上述缸子坐入保温桶，而钢圈架在桶沿上(图3和图4)。简易冷冻干燥机的制作11图3自制简易冷冻干燥机(方案一)至真空泵真空保温桶(液氮罐)液氮冷冻真空室(放冷冻干燥管)硅橡胶密封圈进气阀冷凝室厚壁软管真空表12图4自制简易冷冻干燥机(方案二)至真空泵真空保温桶(液氮罐)液氮冷冻真空室(放冷冻干

7、燥管)硅橡胶密封圈进气阀冷凝室真空表注：冷冻真空室夏天由室温加热，冬天可在外壁缠绕加热带，控温30~40℃。13操作前，将冷冻干燥室和冷凝室清洗干净，控干后用酒精棉擦拭冷冻干燥室内腔，然后在顶盖上的进气管内塞入棉花，关闭进气阀门，连接好真空管线，将冷凝室座入加满液氮的保温桶内，先把冷冻干燥管放入冷凝室内预冻30分钟，移入冷冻干燥室，开启真空泵，进行冷冻干燥。冷冻管内菌悬液确认干燥后，缓慢开启冷冻干燥室的进气阀，释放真空，关真空泵，取出冷冻干燥管进行真空熔封。这一简易冷冻干燥机也可用于其他生物样品以及对热不稳定的水溶