生产菌种的制备与保藏

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1、第六章发酵工业生产菌种的制备1本章内容第三节菌种保藏与复壮第一节孢子制备过程与质量控制第二节种子制备过程与质量控制2发酵工程最重要的就是菌种，发酵水平的高低与菌种的性能、质量、数量有直接关系。目前工业规模的发酵罐容积已达到几百立方米甚至上千立方米，如按5~10%接种量计算，就要投入几十立方米或几百立方米的种子，种子液还要有一定的菌浓和其它质量要求。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。3这就是菌种扩大培养(简称菌种培养)：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培

2、养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为菌种。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。保存菌种扁瓶或摇瓶种子罐试管斜面活化扩大培养扩大培养菌种种子罐4发酵工业生产中菌种扩大培养的目的为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的纯菌种。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，成熟菌体接种量大，发酵时间则短。足够数量的成熟菌种接入到发酵罐，有利于缩短发酵周期，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。从保存的休眠体，逐步培养，到最后一级菌种，其培养基和培养条件逐步接近发酵罐，驯化菌种适应发酵环境，有利于快速的大量产生代谢产物。5发酵工业生产工程中作为菌种必须满

3、足以下条件：菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理形状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。6沙土孢子冻干孢子斜面孢子摇瓶液体培养茄瓶斜面培养茄瓶固体培养种子罐培养发酵罐培养种子制备包括两个过程生产孢子的制备过程：将砂土管或冷冻干燥管保藏的菌种接种至斜面培养基上，成熟后挑选正常的菌落再接茄瓶斜面或固体培养基培养制备大量孢子种子。生产种子的制备过程：制备的孢子移接到摇瓶或种子罐在液体培养基进行扩大培养，制备大量菌丝种子。干接法湿接法7第一节孢子制备过程与质量控制8一、孢子的制备孢子制备是种子制备的开始，是发酵生

4、产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。对于产孢子能力强、孢子发芽快、生长繁殖快的菌种可以将固体培养基培养的孢子可直接接入种子罐作为种子；对于产孢子能力不强或孢子发芽慢、生长缓慢的菌种，则需要把孢子接入摇瓶中使孢子发芽，摇瓶菌丝再接入种子罐作为种子。9第一节孢子制备过程与质量控制1、放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等；C、N源不要太丰富(碳源约为1%，氮源不超过0.5%)，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。C源丰富易造成生长环境呈

5、生理酸性，不利于孢子形成；N源丰富则有利于菌丝繁殖也不利于孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃或30℃，培养时间一般4~7天，也有长至14天的。孢子成熟后，在2~4℃保藏备用，一般存放时间7天，少数可以存放1~3个月。10第一节孢子制备过程与质量控制放线菌发酵生产的工艺过程：母斜面孢子入罐有利于防止菌种变异和染菌；采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。土霉素生产用龟裂链霉菌：培养基：小麦麸皮5-7%，琼脂2.0%，调pH6.8~7.0。培养条件：36.5℃的恒温培养3天，再置30℃恒温培养1天，培养相对湿度50%~55%。保存菌种母斜面(孢子)子

6、斜面(孢子)摇瓶(菌丝)种子罐发酵罐孢子进罐菌丝进罐112、霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、揉皮的麦粒等天然农产品为培养基。营养成分适合霉菌孢子繁殖，这些物质表面积大，易于获得大量孢子。培养温度一般为25~28˚C，培养时间一般为4~14天。产黄青霉菌的种子制备丝状菌球状菌冻干管菌砂土管种斜面母瓶亲米生产米种子罐制成菌悬液米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。12斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等；培养条件：25℃、7天，湿度50%左右；培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。大米孢子培养基：大

7、米及氮源(玉米浆)；培养条件：25℃、7天，控制湿度；培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松，提高比表面积和氧的传质，营养适当有利于孢子的生长。大米孢子的要求：1粒米含1.4×106个孢子。制备好的大米(小米)孢子，可放在2~4℃保存备用，或真空抽干至水分含量在10%以下保存备用，一般可连续使用达半年，对稳定生产很有帮助。抽干法只能用于孢子保存，而不能用于菌丝。13米孢子制备工艺流程浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘不散；分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度；米粒不要碰到瓶塞；培养前期应经常摇动米粒，