生产菌种的培养和保藏

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1、第六章生产菌种的培养和保藏第一节生产菌种的培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。目前工业规模的发酵罐容积已达几十、几百甚至上千立方米；如按5%接种量计，就需投入大量的种子；逐级扩大一、种子的准则1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。2）生理性状稳定3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4）无杂菌污染5）保持稳定的生产能力二、种子制备工艺实验室种子制备阶段：琼脂

2、斜面固体培养基扩大培养摇瓶液体培养生产种子制备阶段：种子罐扩大培养对接种物的一般要求：1）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异。2）生理活性强。若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高。以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子。一)实验室种子制备对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简便，不易污染杂菌。如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直接用于种子罐

3、接种。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。如：用灰色链霉菌生产链霉素用卡那链霉菌生产卡那霉素对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸1、孢子的制备1）细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37˚C。细菌菌体培养时间一般为1-2天，产芽孢的细菌培养则需要5-10天。2）霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、

4、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25-28˚C。培养时间一般为4-14天。3）放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28˚C。培养时间为5-14天。二）生产种子制备种子罐级数的确定种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。一般根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于

5、32℃培养7～10h，菌体浓度达108～109个/ml，即可接入发酵罐作为种子。这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10～24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）在小型罐（5

6、～500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。第二节种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间1）原材料

7、质量生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。如：四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响。制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同1、培养基2）水质的影响地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出

8、现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。2、培养条件1）温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。如:土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等2）湿度制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大影响。不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响相对湿度斜面外观活孢子数（×108/支）16.5～19上部稀薄，下部稠，略黄1.225～36上部薄，中部均匀，发