微生物的分离培养和菌种保藏

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1、实验七微生物的分离、培养和菌种保藏微生物的分离、培养和菌种保藏目的要求实验材料试验程序思考题目的要求初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏的基本方法。练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。实验材料样品：新鲜土壤。培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）。无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水浴锅。试剂：5000U/mL链霉素液0.5％重铬酸钾液实验程序微生物的分离微生物的接种方法（示

2、范）微生物培养中的氧气条件微生物的菌种保藏方法四大类微生物菌落形态的比较和识别实验程序1（微生物的分离）用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。用平板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液的制备同上）。实验程序2（微生物的分离—稀释平板法）制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范）1.称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。2.另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5mi

3、n，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－410－510－6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图-1。实验程序3（微生物的分离—稀释平板法）图－1土壤稀释液的制备和稀释液的取样实验程序4（微生物的分离—稀释平板法）涂平板：每组取培养皿2付，即每个同学做一只。1.先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。2.另取一吸管，以无菌操作法吸取10－4或10－5土壤稀释液1mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加

4、入2滴5000U/mL的链霉素液。此时两液严防相混。3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯蔗糖培养基2管，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、链霉素液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养5～6d。观察真菌菌落形态以及计数菌落。并计算出每g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。挑取单个菌落，接种到斜面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。实验程序5（微生物的分离—稀释平板法）实验程序6（微生物的分离—平板涂抹法）每组取无菌培养皿2付（每个同学做一

5、只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。以无菌操作法先在培养皿中加入0.5％重铬酸钾溶液2滴，取已熔化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入培养皿，使培养基与重铬酸钾充分混匀，铺平，制成平板。凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2mL放在平板上。用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于28～300C条件下培养6～7d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。实验程序7（微生物的分离—平板涂抹法）实验程序8（微生物

6、的分离—平板划线法）每组取无菌培养皿2付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－5或10－6）在平板上划线（教师作示范）。1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线（图－5）。完毕后，倒置于28～300C温室培养。2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线（见图－5）。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28

7、～300C温室培养。挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。实验程序9（微生物的分离—平板划线法）实验程序10（微生物的接种方法）接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图－6）。图－6试验程序11（微生物的接种方法—斜面接种法）实验程序12（微生物的接种方法—斜面接种法）左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔