荧光定量于蕾

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1、实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)RTQ-PCR荧光定量PCR定义在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量.实现了PCR从定性到定量的飞跃。在此技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：在20世纪90年代早期TaqDNA聚合酶的5´核酸聚合酶活性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接检测PCR产物成为可能。荧光双标记探针的运用使得在一密闭的反应管中能实时的检测反应全过程。基本的P

2、CR涉及两个寡聚合甘酸引物，长度为17-30个核苷酸，位于所要扩增的DNA序列两侧。当DNA变性后，引物可以与其相反的链进行杂交而且引物的方向使聚合酶可延两引物质之间的区域进行DNA的合成反应。延伸反应的结果是产生两个双链的靶区域，从而可以进行第二轮的杂交和延伸反应。第三轮产生的两个双链分子完全是双链形式的靶区域。通过热变性，引物杂交，和延伸的重复循环，特异的DNA靶片段很快就会以指数积累起来。在22个循环后，预计扩增量可达到106实时定量PCR就是对原始材料定量的PCR，理论上讲，其实材料（靶序列）和P

3、CR产物的量在任意一循环中都存在一个数量关系，但是实际操作中，扩增反应得到的产物的量是不同的。Higuchi等人最早用溴化乙锭来对扩增的PCR产物定量，扩增出的越来越多的双链DNA结合它就会使荧光增强。但缺点是，无论是特异性的产物还是非特异性的产物都可以产生信号，荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析（常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物）荧光定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量

4、及定性的分析（实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。）实时荧光定量PCR的特点特异性更强灵敏度高可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单起点定量与终点定量定量原理PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期

5、的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。（Baseline）PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光域值threshold（荧光阈值）的设定是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标

6、准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。◇CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。定量原理确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度（该模板的起始拷贝数的对数）与循环数（CT）呈线

7、性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量Ct（循环数）与初始模板的关系模板数固定循环数=荧光信号固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量Threshold104103102定量PCR的数学原理荧光定量PCR方法荧光染料法荧光探针法荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：1、SYBRGreen染料特异性荧光标记

8、：2、TaqMan探针1、SYBRGreen法2、TaqMan探针法可以在PCR时在加入一对引物的同时加入一个特异性的探针。使用的寡聚核苷酸探针在5´端富有一个报告荧光染料基团，在3´端有一个淬灭染料基团。探针完整时，淬灭剂靠近报告染料就会降低报告荧光染料基团发出的荧光，如果有靶序列，探针会在一个引物的下游位点退火，当引物开始延伸时，探针将受到Taq聚合酶5´端的核酸酶活性的切割。探针发生切割后，报告染料即与淬灭染料分离，因而