分子荧光光谱法

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1、实验一分子荧光光谱法分子荧光分析法的基本原理介绍荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质之间的关系荧光分析仪器分子荧光定量分析1.概述一、分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态基态吸收能量受激光辐射退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光源来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法生物

2、发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级激发发射荧光强强激发光物质2.选择性好不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.实验方法简单4.待测样品用量少；仪器价格适中；测定范

3、围较广具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、环境分析等领域。荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法2.荧光光谱法一、荧光光谱的产生具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光基态分子价电子跃迁到激发态光照激发去激发光**n基态在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（、n电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述1.电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的，处于基态单

4、重态。用“S0”表示；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋=0.这种跃迁是符合光谱选律的基态单重态S0第一激发单重态S1S0,S1,S2,S3分别代表基态,第一,二,三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋0。这种跃迁为禁阻跃迁T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态基态单重态S0第一激发三重态T1自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约

5、为10-4~1S分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激2.无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：内部转换（IC）—相同的多重态之间的转换S-S系间窜跃（ISC）—不同的多重态之间的转换S-T振动驰豫（VR）—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内

6、部转换困难T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃3.荧光光谱的产生—辐射去激处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激S1或T1S0发光（1）荧光：当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光，荧光

7、波长比激发光波长长。荧>激T1S0ISCVRVRIC吸光吸光荧光图5-1分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃二、荧光与分子结构的关系了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体（一）荧光效率荧光强度常用荧光量子效率φf来描述荧光量子效率f=发荧光的分子数激发态分子总数f是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧

8、光物质发射荧光的能力，f越大，荧光越强，在0~1之间一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体（二）荧光与有机化合物结构的关系物质只有吸收了紫外可见光，产生*，n*跃迁，产生荧光*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103，寿命短*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱1.