分子荧光光谱法实验报告

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1、实验二、分子荧光光谱法实验姓名：张瑞芳班级：化院413班培养单位：上海高等研究院学号：2013E8003561147指导老师：李向军日期：2013年12月11日第三组一、实验目的1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。4.了解影响荧光产生的几个主要因素。5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。二、实验原理原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分

2、子荧光。具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。(1)激发光谱是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波

3、长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。(2)发射光谱是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找

4、出最大的λem。(3)荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。三、实验试剂和仪器试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanineiodide：标准溶液，10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙6醇。仪器：Fluoromax-4荧光分光光度计；1cm比色皿；spectrofluorometer分析软件。荧光分析仪器结构：它主要由光源、单色

5、器、液槽、检测器和显示器组成。光源发出的紫外-可见或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被检测样品上，样品收到该激发光照射后，发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。荧光分析仪器结构示意图如图1：图1.荧光分析仪器结构示意图一、实验步骤1.样品制备。配置不同浓度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanineiodide溶液，分别为10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度。2.打开荧光分光光度计和电脑，预热半个小时

6、。3.打开spectrofluorometer分析软件，进行相关参数的设置。首先检测罗丹明B的激发光谱，此时固定发射波长为560nm，检测并保存激发光谱。然后根据所检测的激发光谱中的最大峰值541nm来设置检测罗丹明B的荧光光谱的激发波长，检测并保存所得的荧光光谱。4.检测1-萘酚的荧光光谱。方法同步骤3。5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanineiodide标准溶液进行与2中相同的步骤，找到最大激发波长与最大发射波长，之后选定单点检测模式，并设置成刚选择的最大激发波长与最大发射波长，分别对10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml进行检

7、测，记录数据，绘制工作曲线。6.对未知浓度3,3’-Diethyloxadicarbocyanineiodide进行检测，记录数据，并根据工作曲线求出浓度。6一、数据记录和处理1．数据记录(1)罗丹明B的测定图2.罗丹明B的激发光谱图3.罗丹明B的荧光光谱6(2)1-萘酚的测定图4.1-萘酚的激发光谱(3)3,3’-Diethyloxadicarbocyanineiodide的测定图5.1-萘酚的荧光光谱图6.3,3’-