分子荧光光谱法(去磷光)

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1、1第二章分子荧光光谱法MolecularFluorescenceSpectrometry2分子荧光光谱是一种发射光谱分析方法。分子荧光光谱法分子吸收能量后，从基态跃迁到激发态。激发态通常是不稳定的，会释放能量而产生跃迁回到基态，如果是以光辐射的形式释放能量，就称为发光。相应的光谱分析法就称为分子发射光谱法。分子荧光是一种光致发光过程。日本富山海边的荧光乌贼用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画荧光棒4分子荧光光谱法2.1分子荧光的产生过程2.2荧光的激发光谱和发射光谱2.3影响荧光强度的因素2.4分子荧光光谱仪2.5分子荧光光谱法的应用5由分子结构理论，主要讨论荧光的产生机理

2、。1.分子能级与跃迁分子能级的每个电子能级上，都存在振动、转动能级；2.1分子荧光的产生过程基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；62.电子激发态的多重度2.1分子荧光的产生过程单重态：与基态中的电子自旋方向相反，寿命较短.三重态：与基态中的电子自旋方向相同，寿命较长7基态——S0第一、第二、…电子激发单重态——S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态——T1、T2…；2.1分子荧光的产生过程8电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能

3、量的过程；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁2.1分子荧光的产生过程2.分子的去激发过程9S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫2.1分子荧光的产生过程103.分子的去激发形式2.1分子荧光的产生过程振动驰豫同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至相邻低振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12S。见Jablonski能级图113.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程内转换同多重度电子能级中（如S2→S1，T2→T1）,等能级间的无辐射能级交换。见Jablonsk

4、i能级图内转换发生的时间约在10-12S。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。123.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程外转换激发态分子与溶剂和其他溶质分子间的相互作用及能量转移的非辐射跃迁。外转换使发光强度减弱或消失，这种现象称为“猝灭”或“熄灭”。见Jablonski能级图133.分子的去激发过程系间跨跃不同多重态之间如（S1→T1）的一种无辐射跃迁。见Jablonski能级图该过程是激发态电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。即单重态到三重态的跃迁。当两种能态的振动能级重迭时，这种跃迁的几率增大。即较低单重态振动能级与

5、较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。2.1分子荧光的产生过程143.分子的去激发过程荧光发射激发态分子由第一激发单重态的最低振动能级S1回到基态S0伴随的光辐射称为荧光。荧光发射是相同多重态间的跃迁，几率较大，速度很快，10-7～10-9s,见Jablonski能级图S04321S143212.1分子荧光的产生过程153.分子的去激发过程磷光发射激发态分子从第一激发三重态（T1）的最低振动能级上返回基态S0伴随的光辐射称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁（即T1→S0）。故属于“禁阻”跃迁，因此磷光的辐射速度远远小于荧光，约为10-4到10-5s。所以，将

6、激发光从磷光样品移走后，还常可观察到后发光现象。而荧光发射却观察不到该现象。见Jablonski能级图2.1分子荧光的产生过程16荧光激发光谱，简称激发光谱，测量化合物发射的某一固定波长的荧光的强度（选最大发射波长）与激发光波长的关系曲线；1.荧光激发光谱和发射光谱曲线在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。2.2荧光的激发光谱和发射光谱17激发光谱固定em=620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定发射波长(em)扫描激发波长(ex)荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似2.2荧光

7、的激发光谱和发射光谱18B.荧光发射光谱，又称荧光光谱,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。2.2荧光的激发光谱和发射光谱发射光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子荧光的相对发射强度。19ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)发射光谱(荧光光谱)发射光谱的形状与激发波长无关2.2荧光的激发光谱和发射光谱固定激发波长(ex)扫描发射波长(em)20212.2荧光的激发光谱和发射光