生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子...

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1、酶法01药（2）潘映秋酶：生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。酶的特点：主要成分是蛋白质催化效率非常高具有高度的专一性催化活性是受到调节和控制的可催化某些特异化学反应，体内某些物质的合成只能由酶促反应完成酶法以酶为分析对象的分析方法——酶活力测定法以酶为分析工具或分析试剂的分析方法——酶分析法原理和方法：以酶能专一而高效地催化某些化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。一、酶活力测定法概念：1.酶活力：酶催化一定化学反应的能力。（实质：测定一个被酶所催化的化学

2、反应的速度。）2.酶单位：任何一种酶，在25℃以最适当的底物、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化一微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，IU）可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化，且变化程度不断变小，到一定时间，化学反应或者达到平衡，或者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。按所用方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态法或平衡法/终点法。1.酶促反应的条件：要求使待测定的酶浓度成为影响反应速度的唯一因素，其

3、他因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。2.影响因素：a.底物浓度b.pHc.温度d.辅助因子e.未知因素底物浓度的影响1.米氏方程：反映了底物浓度和酶促反应速度间的定量关系。V=Vmax[S]/（Km+[S]）Vmax：最大反应速度；[S]：底物浓度Km：米氏常数；V：底物浓度不足以产生最大速度时的反应速度。2.因此，反应体系应该选择足够高的底物浓度，使反应速度最大化。3.判断标准：底物浓度与Km的关系。一般[S]=100KmpH的影响1.[H+]：改变酶的活性中心的解离状况破坏酶的结构与构象作用反应系统的其他组成成分改变可逆反应进

4、行的方向等影响酶促反应。2.解决方法：借助缓冲系统来控制pH，选择一个合适的缓冲离子和离子强度。温度的影响：直接影响化学反应速度影响酶的稳定性影响酶的构象和催化机制通常选用25℃、30℃或37℃，且控制温度变动于±0.1℃辅助因子的影响未知因素的影响通过空白实验反映。空白实验：杂质反应和自发反应引起的变化量。对照实验：用纯酶或标准制剂测得的结果，作为比较或标定的标准。3.测定方法：取样测定法连续测定法⑴取样测定法：酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止反应（通常采用添加酶变性剂的方法/加热使酶失效）

5、，再根据底物和产物在化学性质上的差异，采用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。酶变性剂：5%三氯醋酸、3%高氯酸或其他的酸、碱、醇等。此类方法和下面将提到的另一类连续测定法相比较，最基本一点的是此类方法停止反应后才测底物或反应物的变化。很难进行连续监测，而另一类方法则不需停止酶反应，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。⑵连续测定法：基于底物和产物在理化性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。优于取样测定法，更准确、效率更高。常用检测方法：注意测定方法与检测方法的区别2.荧光

6、分光光度法原理：底物与产物之一具有荧光，而荧光变化的速度可代表酶反应速度。a.脱氢酶：底物本身在酶反应过程中有荧光变化；b.利用荧光源底物的酶反应。即底物本身无荧光，酶反应后可产生荧光。1.紫外—可见分光光度法原理：底物与产物在某一波长或波段上，有明显的特征吸收差别而建立的连续检测方法。测定范围：几乎所有的氧化还原酶。4.旋光度法：可用于酶反应过程中伴随旋光变化的，但很少用。3.酶偶联测定法原理：应用过量、高度专一的“偶联工具酶”，使被测酶反应能继续进行到一个可直接、连续、准确测定阶段的方法。目前应用最多。酶活力测定时，要先制备两条曲

7、线：酶反应进程曲线和酶浓度曲线。（p340）二、酶分析法分析的对象：1.酶的底物2.辅酶活化剂3.酶的抑制剂分析方法：1.动力学分析法（可用于所有对象的分析）2.平衡法/终点法/总变量分析法（仅用于酶的底物的分析）动力学分析法1.原理：通过条件控制，使底物、辅酶活化剂或抑制剂（即该反应的分析对象）在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这样酶反应速度和相应因素的浓度间有确定的比例关系，测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。2.与酶活力测定法的区别：所用酶量必须一定，被测物以外的其他反应成分处于恒定和最适。3.需注意问题：（1）被测物是酶的底

8、物：底物浓度[S]＜Km酶反应速度与底物浓度成正比（v=k[S]）测定酶反应速度可以得知其浓度。（2）被测物是辅酶：a.可看作双底物反应（辅酶看作底物之一）；b.底物浓度足够高，不影响反应时，可看作单底物反应（3）被测物