《基因工程制药新版》ppt课件

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1、第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例五、宿主细胞的选择和基因导入操作体外重组的DNA分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质。随着时间的推移而逐渐失活。（一）宿主细胞的选择（二）具体的转移技术（三）大

2、肠杆菌中的基因导入和表达（四）酵母菌中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达（一）宿主细胞的选择1、宿主细胞应满足的条件2、宿主细胞的类型1、宿主细胞应满足的条件（1）容易获得较高浓度的细胞。（2）能够利用廉价原料进行生产。（3）不致病。（4）不产生内毒素。（5）发热量低。（6）需氧低。（7）具有一定的细胞形态。（8）需有适当的发酵浓度。（9）容易进行代谢调控。（10）容易进行DNA重组技术操作。（11）产物的产量稳定、产率高。（12）产物容易提取和纯化。2、宿主细胞的类型原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物

3、细胞、昆虫细胞和植物细胞。（1）大肠杆菌（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌（4）酵母菌（5）丝状真菌（6）动物细胞（1）大肠杆菌优点：（1）生长迅速、大规模发酵经济。（2）分子遗传结构清楚、操作简单。（3）基因工程研究中采用最多的表达体系。缺点：（1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。（2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出来，形成杂质。给提取带来困难。（3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。（4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白产物进行糖基化及磷酸化等修饰。（5）大肠杆菌

4、内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。（6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。至2004年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基因重组生物技术药物18种：重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。（2）枯草芽孢杆菌优点：（1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中。（2）不会形成包含体。缺点：（1）不能使蛋白质产物糖基化。（2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌系统，常常对蛋白质产物造成破坏。（3）链霉菌优点：（1）不致病，（2）使用安全，（3）分泌能力强，（4）可将培养产物直接分泌到培养液中，（5）具有糖基化

5、能力近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人们的重视。（4）酵母菌酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中进行克隆和表达。优点：（1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物，（2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行大规模培养，（3）无毒性，（4）基因工程操作简单，（5）表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外，（6）能够对蛋白质产物进行糖基化，（7）真核基因在酵母中表达良好。至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重组生物技术药物8种：胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。虽然酵母

6、表达系统表达的蛋白质有糖基化修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵母表达系统表达。（5）丝状真菌曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了成熟的发酵和后处理工艺。优点：（1）有很强的蛋白质分泌能力，（2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、肽剪切。（6）动物细胞优点：（1）表达产物可以分泌到培养液中，（2）培养液成份完全由人所控制，（3）所分泌的基因产物接近于天然产物，（4）产物容易得到提纯。缺点：（1）生产慢、（2）生产率低、（3）培养条件苛刻、费用高，（

7、4）培养液浓度较稀。至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达的基因重组生物技术药物53种，其中激素类5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种，治疗性抗体17种。表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌主要基因工程表达体系比较（二）具体的转移技术1、转化作用2、转导作用1、转化作用（1）基本概念（2）转化作用的特性（3）感受态细胞（4

8、）人工感受态细胞（5）转化程序（6）影