《基因工程制药》ppt课件

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1、第二章基因工程制药第一节概述第二节目的基因的获得第三节基因表达第四节基因工程菌的不稳定性第五节基因工程菌中试第六节重组工程菌的培养第七节基因工程药物的分离纯化第八节变性蛋白的复性第九节基因工程药物的质量控制第二章基因工程制药一、基因工程技术生产药品的优点二、基因工程药物生产的基本过程三、国内外基因工程药物研究进展第一节概述第一节概述基因工程技术诞生：20世纪70年代现代生物技术的发展基因工程：应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品和

2、服务的技术。一、基因工程技术生产药品的优点1.大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的生理活性蛋白和多肽。2.提供足够数量的生理活性物质。3.开发更多的内源性生理活性物质。4.通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优化天然的生理活性物质。5.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。6.降低成本，提高产品质量。二、基因工程药物生产的基本过程1.目的基因的获得2.构建DNA重组体上游技术3.构建工程菌4.工程菌的发酵5.外源基因表达产物的分离纯化6.产品的检验三、国内外基因工程药物研

3、究进展目前研制的基因工程药物主要包括:1.免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体;2.细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子表皮生长因子、凝血因子；3.激素，如胰岛素、生长激素、心钠素；4.酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激活剂、超氧化物歧化酶等。VitaminA第二节目的基因的获得一、反转录法二、化学合成法一、反转录法1．mRNA的纯化（1）选择表达目的蛋白质丰度高的mRNA的生物材料。（2）分离总RNA。（3）分离mRNA（多聚T纤维素）2．cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物）

4、3．cDNA第二链的合成4．cDNA克隆5．将重组体导入宿主细胞一、反转录法6．cDNA文库的鉴定一、反转录法7．目的cDNA克隆的分离和鉴定一、反转录法优点：准确性高、人工接头、改进、利用局限性：1．小分子量的蛋白或多肽2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序3．费用较高二、化学合成法VitaminB2基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞进攻，保护自身的过程。第三节基因表达1.原核细胞（

5、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）2.真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）一、宿主菌的选择1．原核细胞（1）大肠杆菌优点：遗传背景清晰，生长迅速。缺点：①胞内表达，提取困难。②包含体形式，需复性。③表达后不存在修饰作用，应用受限。④翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子编码）容易引起免疫反应。⑤大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。⑥蛋白酶水解作用破坏产物。一、宿主菌的选择1．原核细胞（2）枯草芽孢杆菌优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。缺点：蛋白酶水解活性更强。（3）链霉菌优点：①不致病②分泌能力

6、强③具有糖基化能力缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差一、宿主菌的选择2．真核细胞（1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之成为理想的宿主。（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。（3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。一、宿主菌的选择1．载体表达载体必须具备下列条件：①载体能独立复制②具有多克隆（MCS）位点和标记基因③具有很强的启动子④具有调节基因⑤具有很强的终止子⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力二、大肠杆菌中的基因表达基因工程药物研究中常用的表达载体（1）PBV220系统①PL、PR串联启

7、动子，增强启动信号。②rrnB基因的终止信号。③PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。④CITS857抑制子基因（温控诱导）⑤质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因二、大肠杆菌中的基因表达PBG-2:由PBV220衍生,可以表达与IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋白剪切位点，便于表达后纯化及纯化后剪切。二、大肠杆菌中的基因表达（2）PET系统①IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷）②多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为ATG，便于外源基因插入表达。③在外源基因的N末端可融合6个His

8、，便于纯化。二、大肠杆菌中的基因表达2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）启动子的强弱（3）SD序列的有效性（4）SD与ATG的间距（5）密码子的组成（偏爱性）（6）产物的稳定性（7）产物对宿主的影响二、大肠杆菌中的基因表达3．表达形式（1）融合蛋白，增强稳定性。（2）非融合表达。二、大肠杆菌中的基因表