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1、三、酵母中的基因表达1.载体：（1）根据载体的复制序列可分为4类：YEp（酵母附加体质粒）、YRp（酵母复制型质粒）、YCp（酵母着丝粒质粒）、Yip（酵母整合质粒）。YEp：此类载体以酵母的天然2μ质粒为基础，带有2μ质粒复制区序列，拷贝数高，转化频率高、稳定性好，应用较广。YRp：复制序列为非2μ来源的自主复制序列，稳定性差，拷贝数少YCp：有ARS、端粒、着丝粒等，类似于染色体的行为，稳定性好，但拷贝数只有1个。YIp：可完全整合到酵母染色体中，稳定性好，但拷贝数只有1个。（2）酵母克隆载体：①含有大肠杆菌的复制原点和抗性基因，可在大肠杆菌中克隆增殖②
2、也可在酵母中进行复制和表型选择。酵母表型选择为营养缺陷型（合成氨基酸或核苷酸的酶系突变缺失）或抗性筛选。（3）表达载体：将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。①普通表达载体：只能方便引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增加并无严格要求。②精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于插入外源基因，并使其在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同。如在构建α-因子精确表达载体时，在其Arg85后引入酶切位点，同时Arg也为酵母蛋白酶断裂位点。2.影响目的基
3、因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数：有些酵母质粒导入细胞后在传代培养中丢失；整合质粒很稳定，但拷贝数低，不能高效表达；高度稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数常会引起细胞生长量的降低。（2）外源基因的表达效率：主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。①启动子：由上游激活序列和保留的近端启动子组成。近端启动子含有转录必须的TATA序列和mRNA起始转录位点ATG。终止子区含有终止转录所需信号。组成型启动子：如果外源基因表达产物对酵母细胞不利，会使细胞生长不良，达不到所需的细胞密度。诱导型启动子：②分泌信号的效率：分泌信号包括信号肽部分及
4、前导肽部分的编码序列，可帮助表达产物分泌出酵母细胞并在适当部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。③终止序列的影响：终止序列保证了转录产物在适当部位终止和加上polyA尾巴，这样形成的mRNA才能比较稳定并被高效翻译。（3）外源蛋白的糖基化：N-糖苷键、O-糖苷键（4）宿主菌株的影响：①菌体生长能力强②菌体内源蛋白酶较弱③菌株性能稳定④分泌能力强酵母系统表达的优点：（3）某些酵母表达系统具有外分泌信号序列,能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外,因此很容易纯化。（1）酵母生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程
5、产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。（2）酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。解决内部降解的方法：（1）在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物,通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用（2）将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0～8.0的范围内生长),以抑制中性蛋白酶的活性;（3）利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。酵母表达系统的不足之处：（1）产物蛋白质的不均一（2）信号肽加工不完全
6、（3）内部降解（4）多聚体形成等,造成表达蛋白质在结构上的不一致。（5）还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。利用酵母菌表达外源基因的策略（1）增加整合在酵母染色体上的目的基因剂量（2）控制外源基因中的AT含量（3）选择最为合适的信号肽（4）外源基因在酵母菌表达的影响因素还有很多,如整合位点、mRNA5′和3′非翻译区(UTR)、宿主菌的Mut表型、蛋白酶、表达蛋白质自身的特点、培养基及培养的环境条件等,有效控制各种影响表达的因素,对于外源基因的高效表达都必不可少。用酵母表达系统(宿主--载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae
7、)：难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C端往往被截短。（2）甲醇营养型酵母表达系统：包括汉森酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长,甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶,如醇氧化酶Ⅰ(AOX1)等。（3）裂殖酵母(Schizogenesispombe)表达系统：具有许多与高等真核细胞相似的特性,它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性，但目前研究较少。（1）将目
8、的基因克隆入酵母表达载体（2）用适当的限制性内切酶消
