《基因工程制药》ppt课件

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1、基因工程制药基因工程药物:利用基因工程技术生产人体健康所需的、难以用传统方法制取的蛋白质、多肽和基因等药物。基因工程药物包括:基因工程治疗药物，基因工程抗体和疫苗，基因治疗药物，基因工程诊断试剂等。基因工程药物生产的基本过程获得目的基因→目的基因克隆→构建重组表达载体→构建、筛选基因工程细胞→工程细胞培养→表达产物的分离、纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装。目的基因的获得从基因组中获得从基因组文库中获得从cDNA文库中获得PCR扩增法从化学合成方法中获得免疫法分离目的基因mRNA选择宿主细胞的原则安全性高、便于导入重组DN

2、A、便于筛选克隆子、重组子能在细胞内稳定维持、不影响外源基因高效表达、具有较好的翻译后加工系统、遗传密码无特别的偏倚性、遗传性稳定，易于扩大培养、有较高的应用价值。外源基因表达常用的宿主细胞大肠杆菌表达系统优点：遗传背景、代谢途径和表达机制清楚；易于遗传学操作；生长迅速；异源蛋白的高效表达;也可以分泌型表达缺点：潜在致热源；蛋白质不分泌到培养基中；无翻译后修饰系统；异源蛋白而易形成包函体外源基因表达常用的宿主细胞枯草芽孢杆菌表达系统优点：不产生内毒素；良好的分泌型；天然构象的可能性大。缺点：外源蛋白表达量较低；细胞内外高水平的蛋白

3、酶。外源基因表达常用的宿主细胞酿酒酵母表达系统优点：简单的真核生物，不产生病毒，内毒素；遗传背景清楚；有翻译后修饰；分泌异源蛋白。缺点：异源蛋白表达量低；有超糖基化趋势；异源蛋白有时分泌不理想，〉30Kd不分泌，乙醇积累导致异源蛋白合成不足。外源基因表达常用的宿主细胞动物细胞表达系统CHO、COS、3T3优点：可分泌异源蛋白；正确的糖基化和翻译后修饰缺点：异源蛋白表达量低；难以大规模生产；培养基昂贵；培养时间长；培养条件苛刻重组DNA转化宿主细胞的途径直接转化法、化合物诱导法、接合转化法、噬菌体转染法、电穿孔转化法、基因枪轰击法、

4、超声转化法、脂质体介导转化法、磷酸钙转化法等。重组子的鉴定1.根据重组子的特征鉴定DNA分子的大小、酶切图谱、PCR扩增片断、DNA杂交法、DNA测序2.根据转录产物鉴定Northern、RT-PCR3.根据翻译产物鉴定蛋白电泳、ELISA、Westhern、RIA异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达包涵体形成的机理：外原基因的表达产率过高。无真核细胞的亚细胞器结构和稳定因子宿主细胞的异源蛋白。所处的环境不利于折叠。高浓度异原蛋白造成高浓度的微环境。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达包涵体---生物大分子致密地聚集在

5、细胞內，形成的高密度、不溶性的无膜的颗粒结构。包涵体的性质---主要是表达的外原蛋白，其高级结构往往是错误的。只有在变性剂中才能溶解。要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的错误折叠蛋白质，将各个次级键打开，在体外进行蛋白质的重折叠。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式包涵体型表达的优缺点优点：外原基因的表达量极高，对宿主细胞的生长和代谢影响小抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化缺点：必须复性异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型表达分泌型表达的特点：在N端加上能够跨膜的信号肽序列。这对重组蛋白

6、的折叠可能有一定好处；由于跨膜是逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中的重组蛋白也可能形成包涵体。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式分泌型表达分泌型表达的优缺点优点--1可溶性表达2可能接近天然构象3Met可被切除缺点--1表达量低2纯化较困难3面临复性问题异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型表达融合型表达的特点：将高量表达的宿主蛋白基因与外源基因拼接在一起，大量表达内、外原杂合蛋白。在融合蛋白中，外源表达产物

7、能在菌体蛋白的引导下形成较好的杂合折叠构象，封闭了部分重组蛋白上的酶切敏感位点，增加了抗酶解能力。异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型表达融合型表达的优缺点：优点---1．稳定性强2．比单纯分泌表达产量高缺点---1．需将融合蛋白两者分开，对酶切试剂和工艺的要求高2．可能面临体外复性问题异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式融合型表达融合型表达系统的构建原则：选择能够高效表达的宿主结构基因，尽量避免融合蛋白中两者的理化性质过于接近，以利于异原蛋白的分离。两种蛋白之间留有特定的分割位点，能够准确分离。切割融合型蛋白的条件蛋白内切酶的纯度

8、一定要高选用断裂位点专一性最强的酶目的蛋白内部不存在同样的切割位点严格按照相应酶切的最佳条件进行几种常用的融合蛋白表达载体ProteinA(葡萄球菌A蛋白)GST（谷光甘肽S-转移酶）CBD(几丁质结合功能区)(纤维素结合功能区)MBP(麦芽糖结合