基因工程常用受体细胞

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1、第三章：基因药物体外表达的受体细胞第一节、宿主细胞选择原则1、容易获得较高浓度的细胞；2、安全，不致病；3、遗传背景清楚，容易进行DNA重组操作及遗传改造；4、产物的产量高（表达水平和稳定性）、生物活性高5、产物容易提取纯化。6、容易进行代谢调控；7、易培养（生长速度、营养需求、氧耗量等），培养成本低第二节、宿主细胞分类及特点分类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等）真核细胞（酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞）一、原核表达系统的特点（一）优点：1、结构简单，基因组成及功能相对清楚，易于遗传操作及转化2、

2、生理代谢途径及表达调控机制相对清楚，便于表达调控3、生长迅速，要求条件低（大肠杆菌倍增时间为17分钟），易于大规模培养。（二）缺点1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA，只能表达cDNA；2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、酰胺化等修饰作用；蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从而获得功能性分子糖基化意义：赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性3、不具备真核生物的蛋白质复性系统（如蛋白二硫键异构酶），不能进行真核蛋白的正确折叠；二、酵母（yeast）

3、表达体系特点酵母菌是最简单的真核单细胞生物；是外源真核基因最理想的表达体系。（一）优点：1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便2、具有原核生物无法比拟的蛋白翻译后加工修饰系统。对表达的蛋白可进行正确折叠和糖基化、磷酸化等修饰；3、安全：不含特异病毒、不产生毒素，美国FDA认定为安全的4、繁殖迅速（倍增期约2小时），要求条件低，大规模发酵工艺简单，成本低廉；5、能外分泌（二）缺点：1、生长相对细菌缓慢2、对有些生物活性蛋白仍无法表达或正确修饰，比如蛋白超糖基化超糖基化修饰作用酵母菌糖蛋白的N－糖

4、基外链的组成成分只有甘露糖，但其分支结构极为复杂的的现象称为超糖基化修饰作用。酵母菌高等真核生物O－寡聚多糖链甘露糖单体唾液酸基团N－糖基外侧链甘露糖甘露糖N－乙酰葡萄糖胺半乳糖果糖唾液酸等N-连接糖基化(N-linkedglycosylation)新合成蛋白进行糖基化修饰的一种方式。糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基连接，所以将这种糖基化称为N-连接的糖基化。O-连接的糖基化（O-linkedglycosylation）高尔基体中进行的另一种蛋白质的糖基化，将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟

5、基的氧原子上。三、哺乳动物细胞表达特点是表达哺乳动物基因（如人基因）的最好受体细胞。优点：1、能识别和剪切内含子并加工为成熟的mRNA，既可表达cDNA又可表达基因组DNA；2、表达产物具有正确地高级结构和糖基化、磷酸化等修饰。3、表达产物可分泌到培养液中，纯化容易。缺点：1、细胞生长慢，培养条件刻苛，大规模培养工艺复杂、费用高2、培养液中产物浓度较小3、转化细胞筛选麻烦主要基因工程表达体系比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差

6、酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌第三节、常用原核表达细胞大肠杆菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌一、大肠杆菌表达体系（一）生物学特性革兰氏阴性杆菌大小2～4um×0.4～0.1um；无芽孢；一般无荚膜(capsule)裂殖(Fission)分裂，37℃17分钟繁殖一代。（二）特点优点：1、载体受体系统完备2、外源基因表达水平高，可达总蛋白5％～30％；3、下游技术成熟缺点：1、胞内表达蛋白易形成无活性的

7、包涵体，需进行复性操作；可溶性表达的胞内真核蛋白易被细菌蛋白酶水解2、蛋白分泌机制不健全，外源真核基因很难实现分泌表达，且分泌产物大多只能分泌到细胞周质（细胞质与外膜之见的间隙）；少数分泌表达的蛋白表达效率比包含体形式低很多。3、胞内表达产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基（由起始密码ATG编码），影响活性或容易引起免疫反应4、细胞壁含脂多糖（内毒素），增加了分离纯化难度包涵体细胞内由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或无膜的水不溶颗粒状物（相差显微镜或电子显微镜下可见）。组成：1、外源重组蛋白：50％以上2、宿主

8、蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白体、外膜蛋白等3、质粒编码蛋白：如标记基因产物4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等蛋白特点：氨基酸序列组成正确，空间构象往往错误（三）在基因工程中的应用扩增外源DNA（双链、单链）构建基因文库（DNA文库、cDNA文库）高效表达原核生物基因表达不需翻译后加工、修饰的真核蛋白五、实验室常用的大肠杆菌用于接受质粒：C600W3110HB101JM83JM1