基因工程-6章-重组DNA导入受体细胞.ppt

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1、2021/10/41载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a.未连接的载体分子b.未连接的DNA片段c.载体的自连d.含有错误插入片段的重组DNA分子e.重组DNA分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制重组DNA技术操作过程可形象归纳为分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体第六章重组DNA导入受体细胞一、受体细胞二、选择受体细胞的基本原则三、重组DNA导入

2、受体细胞的方法2021/10/45一、受体细胞受体细胞(receptorcell)又称为宿主细胞(hostcell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。感受态(competence)是指细菌吸收外源DNA的生理状态。感受态细胞(competencecell)是指具有接受外源DNA能力的细胞。2021/10/46基因工程常用的受体细胞有:大肠杆菌枯草杆菌土壤农杆菌酵母菌植物细胞动物细胞大肠杆菌1、原核生物细胞的优点①大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。②没有核膜，染色体DNA没有固定结合

3、的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。④原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。2021/10/49原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：①原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。②原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。

4、③原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。2021/10/410酵母菌2、酵母菌酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点①酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对较为简单。②具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。③不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属(如酿酒酵母)有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。④培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。⑤能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。2021/10/4123、动物细胞常

5、用的动物受体细胞有Hela细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞(CHO)等。2021/10/413MCF-7哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：①能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的RNA。②真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞16-20倍。③易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。④经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞，通常需要数月之久,难度较大。二、选择

6、受体细胞的基本原则①便于重组DNA分子的导入。②便于重组体的筛选。③遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。2021/10/415④受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。2021/10/416⑥能使重组DNA

7、分子稳定存在于细胞中。⑦受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。⑧具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。2021/10/417AminoacidRarecodonUrchinHMG1LampreyHMGB1LampreyHMGB2LampreyHMGBXtroutHMG1FrogHMG1TurtleHMGB1ChickHMGB1MouseHMGB1HumanHMGB1HumanHMGB2HumanHMGB3LeuCTA001000001020IleATA10011

8、2100000ProCCC367741126334ArgCGG023410121122AGA610044013211AGG542033212232GlyGGA315523223625Total1814181715137816141314稀有密码子：三、基因导入受体细胞方法转化(transf