重组DNA导入受体细胞

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1、第七章重组DNA导入受体细胞载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a.未连接的载体分子b.未连接的DNA片段c.载体的自连d.含有错误插入片段的重组DNA分子e.重组DNA分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制一、转化方法自然界中，转化并不是细菌遗传信息传递的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化

2、效率，建立了一系列的转化方法：供体菌游离DNA供体菌DNA（转化因子）转化示意图a.热激法转化感受态细胞b.PEG介导的原生质体转化c.高压电穿孔法转化d.显微注射法转化e.接合转化f.噬菌体转染大肠杆菌常用转化方法的比较转化方法转化效率Ca诱导107-8原生质体转化105-6噬菌体转化107-8电穿孔法106-9（<100Kb）接合转化104-5一）受体细胞应具备的条件a.限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）b.重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）c.具有较高的转化效率d.具有与重组体

3、互补的遗传性状e.感染与寄生缺陷型安全角度的要求。二）大肠杆菌感受态的制备与转化感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcells)。1、热激法转化感受态细胞2、氯化钙法转化在某些情况下，CaCl2只影响DNA的结合，并不影响细胞的吸收，当DNA分子加到处理的细胞内，仍然吸附在细胞的外部，并没有转化到细胞质中，将DNA带入感受态细胞的条件可提高温度到42℃。3、PEG介导的原生质体转化4、高压电穿孔法（1）基本原

4、理在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。(2)影响因素脉冲的最大电压脉冲持续的时间与DNA浓度则无多大关系电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为10-4～10-5之间。5、显微注射法转化在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术、人工受精、细胞核移植、基因注入、细胞内微量注射、胚胎切割等的技术。（1）真正的显微注射(truemicroinjection)法DNA是由注射针直接注入细胞（2）“穿刺”(pr

5、icking)导入法DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生长的单层细胞。显微注射分为6、接合转化不需要细菌细胞的直接接触基因重组的范围更小，只限于更小的一段染色体片段和少数几个紧密连锁的基因细菌的“接合”状态接合----F+×F－F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient染色体染色体质粒F+菌F-菌F质粒的半保留转移F+菌染色体Hfr质粒F+菌F质粒转移的不同结果F’质粒二、pha

6、geDNA的转化两种方法可以将噬菌体DNA转入细菌：1）转染（transfection）：是将纯化的噬菌体DNA通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。2）体外装配（invitropackaging）：λDNA的转染效率不高，如果将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。噬菌体转化大肠杆菌的方法一）λDNA的转染λDNA的转染作用，是一种低效的过程。使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率（即每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为105～106之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了104～10

7、3左右。二）λ噬菌体的体外装配有两种不同的系统可以应用：　　一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。　　另一种系统需要两种不同的缺陷品系，一个是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变体。λ噬菌体体外装配的两种系统