重组基因导入受体细胞1

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1、二、依赖于重组子结构特征分析筛选(一)快速裂解菌落鉴定分子大小主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中，落后的带是重组DNA的带。这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，直观快捷，只须获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。此方法只用于重组子的初步鉴定

2、。(二)限制性内切核酸酶消化载体被外源片段插入后，其限制性酶切割产物会发生变化，可根据电泳结果来判断外源基因是否插入了载体及其插入方向。通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子，因为重组质粒DNA分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及

3、其插入方向等。完全酶切简单操作过程是，用一种或两种能将外源DNA片段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒DNA，凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质粒多出一条泳带，据此将重组子和非重组子分离开来。如果插入片段与载体质粒大小相近，则最好用合适的酶将之线性化，通过比较大小确定其是否为重组分子。进一步利用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向等。部分酶切通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒DNA分子进行部分酶解分析，根据部分

4、酶解产生的限制性片段大小，确定限制性核酸内切酶识别位点的准确位置及各个片段的准确排列方式，从而将期望重组子筛选出来。部分酶解法较全酶解法简单易行，两者通常用于当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应(如只有酶切后的载体或只有外源DNA片段)都明显多时的重组筛选。三、核酸分子杂交分析(一)分子探针分子探针是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子或蛋白质分子。分子杂交核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。分子杂交：

5、生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。理想的探针标记物应满足的条件：1)标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特异性、杂交稳定性及酶反应待征等；2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；3)操作简便、省时．经济实用：4)化学稳定性高、易于长期保存；5)安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类。1.放射性标记物放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的

6、放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为常用。32P标记的核苷酸具由高放射性，放射自显影检测灵敏度高，但其分辨力低，半衰期短(14.3d)，探针不能长期保存。与32P标记物相比，35S的放射性较弱，检测灵敏度低，但其分辨力高，放射自显影的本底低，适于细胞原位杂交等。半衰期较长(87.1d)，辐射危害较小，使用较为方便安全。3H主要用于制备高分辨力的原位杂交探针，因其释放的放射能很低，放射自显影的本底也不高．但却需较长的曝光时间。半衰期长(12.35a)，标记探针可较

7、长时间保存。标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。2.非放射性标记物非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有生物素(biotin)标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸和荧光素(fluorescein)标记的核苷酸等。此外，乙酰基氨基芴(AAF)或乙酰基氨基碘芴(AAIF）、汞离子、金颗粒、银颗粒及磺基等标记的核苷酸也能作为标记

8、物使用。3.探针标记方法探针的标记有体内标记及体外标记两种方法。体内标记法是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入3H-胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞DNA分子上。体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。体外标记包括化学法和酶法两种。化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因(如磷酸基团)发