基因工程的载体和受体

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1、第三章基因工程的载体和受体（ChapterIIIVectorsandHostsforGeneCloning）1一、用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征2携带外源DNA进入宿主细胞的工具能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞1.载体的概念（一）载体的功能及特征32.载体的功能（functionofvector）运送外源基因高效转入受

2、体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件43.载体应具备的条件（characteristicsofvector）可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，originofreplication）或整合位点具有较高的外源DNA的装载能力多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点具有合适的筛选标记（selectionmarker）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中5质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考

3、斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体4.载体的种类6（二）质粒（plasmid）1.质粒质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。质粒DNA的分子量范围：1-300kb。功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。7（1）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷

4、贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：1-3拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒：10-60拷贝relaxedplasmid但细胞生长环境中，存在蛋白质合成抑制剂（氯霉素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，但质粒仍可扩增，使其数量可达数千拷贝。2.质粒的基本特征8（2）质粒的不相容性（incompatibility）任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、R

5、P4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群。9质粒不相容的分子机制两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。10（3）质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个

6、细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F质粒。如Col、R质粒的一些成员。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。11（4）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。123.几种代表性质粒F–因子（fertilityfactor）：又

7、称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibi

8、oticresistan