18 amino acids analysis(PITC derivation precolumn)

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1、HPLCApplicationsDikmaTechnologies18种天然氨基酸分析(异硫氰酸苯酯柱前衍生法)——序列号:D0241适用范围该方法适用于氨基酸注射液、动植物性食品和饲料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸的检测2溶液配制氨基酸储备液：称取一定量氨基酸标准品，用0

2、.1mol/LHCl水溶液溶解，胱氨酸为0.01mol/L，酪氨酸为0.02mol/L，其他氨基酸为0.05mol/L氨基酸使用液：将储备液用0.1mol/LHCl水溶液稀释，得到浓度为0.002mol/L的氨基酸单标和混标内标液：以正亮氨酸作为内标物。称取一定量正亮氨酸，溶于0.1mol/LHCl水溶液，得到0.02mol/L的正亮氨酸内标液异硫氰酸苯酯溶液：将250μl异硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至10ml，得到0.2mol/L异硫氰酸苯酯溶液三乙胺溶液：将1.4ml三乙胺用乙腈定容至10ml，得到1.0mol/L三乙胺溶液3衍生化3.1样品溶液衍生化[1]量取200μl样品溶液(蛋

3、白质水解液或游离氨基酸溶液)，置于1.5ml塑料离心[2]管中，加入20μl正亮氨酸内标溶液，混匀，再加入100µl1mol/L三乙胺乙腈溶液和100µl0.2mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然HPLCApplicationsDikmaTechnologies后加入400µl正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5~10s，静置分层，取200µl下层[3]溶液与800µl水混合，0.22µm针式过滤器过滤，待分析。3.2标准溶液衍生化量取200µl氨基酸混合标准溶液(每种组分浓度均为0.002mol/L)，置于1.5ml[2]塑料离心管中，准确加入20μl正亮氨酸内标溶液、1

4、00µl1mol/L三乙胺乙腈溶液和100µl0.2mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然后加入正己烷400µl，旋紧盖子后剧烈振荡5~10s，静置分层，取200µl下层溶[3]液与800µl水混合，0.22µm针式过滤器过滤，待分析。注：[1]通过控制原始样品质量或稀释等方法，使样品溶液中的氨基酸总量不超过0.04mol/L或3.0g/L(两者中取最小值)[2]只有采用内标法分析时，才需要加入正亮氨酸作为内标物[3]衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈，这与流动相溶剂体系存在较大差距，因而需要加水稀释，否则会引起峰前沿或分叉4分析条件色谱柱:DiamonsilAAA

5、氨基酸分析柱，250×4.6mm，5μm流动相A:0.05mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50±0.05)流动相B:甲醇:乙腈:水=20:60:20(V:V:V)流速:1.0ml/min柱温:35℃进样体积:10μl梯度程序二元高压HPLC系统比如Shimadzu10A、20A、Agilent1200，双泵后配备1.7～2.6ml涡流混合器时间/min03940454660流动相A/%9552009595HPLCApplicationsDikmaTechnologies流动相B/%5481001005520111991213151845816176372114101020

6、3040Time(min)18种天然氨基酸、正亮氨酸以及NH3(氨)-异硫氰酸苯酯衍生物的液相色谱图1Asp(天冬氨酸)2Glu(谷氨酸)3Ser(丝氨酸)4Gly(甘氨酸)5His(组氨酸)6Arg(精氨酸)7Thr(苏氨酸)8Ala(丙氨酸)9Pro(脯氨酸)10NH3(氨)11Tyr(酪氨酸)12Val(缬氨酸)13Met(蛋氨酸)14Cys(胱氨酸)15Ile(异亮氨酸)16Leu(亮氨酸)17Nle(正亮氨酸)18Phe(苯丙氨酸)19Trp(色氨酸)20Lys(赖氨酸)包括18种天然氨基酸、正亮氨酸内标物以及NH3(氨)-异硫氰酸苯酯衍生物在内的20种化合物完全得到分离，相

7、邻色谱峰的分离度大于2.0。