生姜蛋白酶的生物大分子修饰

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1、生姜蛋白酶的大分子结合修饰作者：刘恩岐，张建萍，贺菊萍文章来源：生物谷报告人：西安交通大学10122004申世红生姜及生姜蛋白酶的简介生姜蛋白酶：是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。应用：医药工业；食品工业；日化工业；饲料工业；皮革工业生姜蛋白酶生姜及生姜蛋白酶的简介文章背景知识：1.天然生姜中蛋白酶的缺点：稳定性差、失活快，限制了生姜蛋白酶在生产中的推广应用。2.修饰方法：大分子结合修饰是目前应用最广的酶蛋白修饰方法之一，对

2、提高酶活力、增强稳定性具有显著效果。3.常用的修饰剂：聚乙二醇：聚乙二醇(PEG)是一种线性、无毒且不带电的水溶性大分子。右旋糖苷：由D-葡萄糖通过α-1,6糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。文章结构文章结构材料与方法结果与分析结论与讨论材料与试剂：生姜（市售鲜生姜）；单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)；右旋糖苷(dextran40000)；三聚氯氰(C3Cl3N3)；高碘酸钠；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)；硼氢化钠；聚乙二醇(PEG20000)仪器与设备：PHS-3C精密pH计；THZ-82型数显式电热恒温水

3、浴锅厂；HJ-3型数显恒温磁力搅拌器；TU-1810紫外-可见分光光度计LGJ-18A型冷冻干燥机第一部分：材料与方法方法：生姜蛋白酶的制备：1.将新鲜生姜洗净、切丁，每1kg生姜加入4℃预冷的磷酸缓冲液2L。用高速组织捣碎机搅碎制成匀浆，离心弃渣取上清液。2.将离心姜液进行超滤处理，得到相对分子质量大于10000、小于50000的生姜蛋白酶浓缩液。将生姜蛋白酶浓缩液与4℃预冷的丙酮按一定的比例混合（数据来源于本文参考文献），离心弃上清液，取沉淀自然风干，制得生姜蛋白酶粗粉。3.将生姜蛋白酶粗粉用磷酸缓冲液溶解后，经葡聚糖凝胶G-200和二乙氨基乙

4、基纤维素DE52进行两次柱层析纯化，透析脱盐后经冷冻干燥得到生姜蛋白酶纯品第一部分：材料与方法生姜蛋白酶活力的测定原理：生姜蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，在碱性环境下，酪氨酸与福林试剂作用产生有色物质，于波长660nm处进行光密度(OD)测定。光密度与酪氨酸的浓度成正比。酪氨酸的量来表示生姜蛋白酶分解蛋白质的能力。（在这里笔者定义：在40℃、pH6.0条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。具体测定方法参见SB/T10317—1999《蛋白酶活力测定法》。）材料与方法：生姜蛋白酶酶活力测定单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶

5、的修饰单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化：采用三聚氯氰活化法[7-8]（此处笔者仅提供了参考文献）活化mPEG化学修饰生姜蛋白酶的制备：在酶液质量浓度为2.0mg/mL的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中，加入一定比例的活化mPEG修饰剂，于40℃水浴中保温反应lh;磷酸缓冲液(0.lmol/L，pH7.0)中透析24h，用截留相对分子质量为10000的超滤膜超滤，截留浓缩液，冷冻干燥即得mPEG修饰的生姜蛋白酶。。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定，探讨活化mPEG的用量和pH值对修饰效果的影响。材料与方法：单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰材料与方法：右

6、旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰右旋糖苷的活化:采用高碘酸钠活化法（此处笔者仅提供了参考文献）活化右旋糖苷化学修饰生姜蛋白酶的制备：在酶液质量浓度为2.0mg/mL的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中，加入一定比例的活化右旋糖苷修饰剂，于40℃水浴中保温反应lh，添加NaBH4(50mg/mL)终止反应。调pH值至7.0，对水透析4h，再用PEG20000反透析浓缩后，冷冻干燥即得修饰的生姜蛋白酶[12]。。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定，探讨活化右旋糖苷的用量和pH值对修饰效果的影响。酶修饰率的测定酶修饰率的测定：方法：采用TNBS法

7、；原理：酶蛋白表面的游离氨基与过量的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)反应，生成三硝基苯酚的衍生物，在335nm波长处有最大吸收峰。过程：取1mL含1mg生姜蛋白酶的溶液，加入1mL质量分数为4%、pH8.5的碳酸氢钠溶液和1mL质量分数为10%的十二烷基磺酸钠溶液，20min后加入1mL质量分数为0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，40℃保温2h；酶修饰率的测定酶修饰率的测定：过程：335nm波长处测定吸光度。同样浓度的酶液在修饰反应后与反应前吸光度之比即为残留氨基量。数据处理:式中：A1为酶液修饰反应前吸光度；A2为酶液修

8、饰反应后的吸光度。第二部分：结果与分析活化mPEG对生姜蛋白酶修饰条件的筛选活化mPEG用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响在酶