生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究

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1、桂林理工大学生物工程专业技能实习报告生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名：指导教师：摘要：本文通过比较研究生姜蛋白酶的提取纯化工艺，采用丙酮沉淀法对生姜蛋白酶进行初步纯化后，通过双水相萃取，反胶束萃取对生姜蛋白酶进行进一步纯化比较，分析了在双水萃取中聚乙二醇分子量，聚乙二醇浓度，硫酸铵浓度、酸盐浓度，磷酸盐缓冲液pH对萃取效果的影响。对反胶束萃取中KCl浓度以及W0值对萃取效果的影响。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取ResearchonextractionandpurificationofGingerproteaseStudent:YANGTea

2、cher:Abstract:Thisarticlethroughthecomparativestudyofgingerproteaseextractionandpurificationtechnology,usingacetoneprecipitationofgingerproteaseforpreliminarypurification,throughthetwophasepartitioning,reversedmicelleofgingerproteaseforfurtherpurificationcomparison,analyzesthedualwaterextraction

3、inthemolecularweightpolyethyleneglycol(peg),polyethyleneglycol(peg)concentration,ammoniumsulfateconcentration,acidsaltconcentration,phosphatebuffertotheeffectsofthepHextraction.ToreversemicelleconcentrationintheextractionofW0valueandKClextractioneffect.Keywords:Gingerprotease;organicsolventextra

4、ction;ammoniumsulfatesalting-out;aqueoustwo-phaseextraction;anti-micelleextraction29桂林理工大学生物工程专业技能实习报告前言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味[1]。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度

5、。我国传统食品“姜撞奶”用姜汁作为凝乳剂，其中的凝乳因子被证明就是生姜蛋白酶。[2]开展生姜蛋白酶的研究将会为其在食品领域的应用提供理论依据,改变我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖于木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状,对于稳定生姜种植面积,保证生姜产业持续高效发展,扩大生姜资源的利用途径,调节农业产业结构均具有重要意义,对于进一步丰富生姜蛋白酶的酶学性质和以生姜为原料开发新型的营养保健制品也具有积极的作用和指导意义。生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶

6、及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤→取浓汁→真空冷冻干燥保存。近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000年，Kyung在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法：生姜切成小块，3℃下，在1000mL20mM7.0的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌1h然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用500mL缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入2％的氯化钠，搅拌2h，在4℃下15000g离心30min。

7、上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至20％饱和度，将溶液搅拌1h，然后13000g离心30min，上清液继续添加硫酸铵至60％饱和度，用NaOH调节pH至7.2，4℃下搅拌3h，离心取沉淀，用约150mL20mMpH为7.0的磷酸缓冲液（含有5mM的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为12000的透析袋对20mMpH为7.0的磷酸缓冲液（其中含有5mM的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析16h以上。透析液在4℃下10000g离心30m