毛细管电泳分离技术

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1、第三章　毛细管电泳分离技术第一节　概　述电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁移速率不同而得到分离的一类方法。（electrophoresis）发展历程1807年，FerdinandFredericReuss就观察到了荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运者的意思)20世纪30年代，通过Tiselius的研究，电泳技术才得到有实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年度的诺贝

2、尔奖。到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的平面色谱技术一样的实验室常用技术。20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成为了一种“灰姑娘”式的技术1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技术。1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用

3、到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。第二节　毛细管电泳基本原理一、毛细管电泳的理论基础毛细管电泳法：是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和/或分配行为的差异而实现分离的一种分析方法。在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力：电泳力电渗力（一）电泳和电渗电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离子、胶团)在电场中定向移动的现象。电泳是驱动电解质运动的第一种动力。电泳迁移速度Ve:Ve=μeE=μeV/L注：μe:电泳迁移率(

4、电泳淌度);E:电场强度;V－毛细管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。μe=νe/E=Q/f当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液的粘度及带电离子的大小有关。注：Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂化层)电渗(Electroosmosis)是驱动电解质运动的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在直流电场作用下发生定向运动。电渗流的产生毛细管内壁表面上的硅醇基在pH>3的水溶液中，可电离而产生SiO-负离子，使毛细管内壁带上负电荷，

5、因此，溶液中的一部分正离子就靠静电作用而吸附于毛细管内壁上，形成一个双电层(Electricdoublelayer)。其中一层是带负电的内壁，一层是带正电的溶液离子吸附层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远，越呈自由状态，于是在吸附层之外又存在着一个扩散层。固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的滑动面上，此处的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用，它在电场中发生迁移时，将带动整个溶液向阴极移动，所以就形成电渗流（ElectroOsmoticFlow,EOF）。电渗流速度Veo与ζ电位、ε、

6、E成正比，而与介质的粘度η成反比。电渗流迁移率介质的介电常数界面电动势介质的粘度溶剂流迁移速度与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面流型，它不存在径向梯度。电渗流的意义电泳过程中伴随着电渗现象电渗流的速度比电泳速度快5-7倍利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之和。Vi=Ve+Veo当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子将按下面的速度迁

7、移到阴极，到时间t时，A、B物质已经分离了。正离子：νt=νeo+ν+中性分子：νt=νeo负离子：νt=νeo-νˉ注：电渗流的速度为泳流的若5-7倍抑制毛细管中电渗流的办法：消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度；在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂层。具体方法有：电渗流是毛细管电泳分离的重要参数，控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度(二)分离效率和分离度1、分离效率柱效可用理论塔板数n表示理论塔板高毛细管电泳分离柱效方程式实验上可按下式求出理论塔板数毛细管有效长度毛细管总长度两端电压溶质扩散系数电泳湍

8、度电渗湍度电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离电泳峰的半高峰宽提高分离电压是增加分离效率的主要途径，在相同的操作电压下，l/L=1，分离效率最高（短的毛细管）。此外，N与溶质的