《转基因动物》PPT课件(I)

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1、基因工程动物第一节实验动物的胚胎工程胚胎工程是指运用人工方法对动物的胚胎及配子进行操作和改造，是改良动物品种品系，保存动物种子资源及转基因动物制备的重要手段。主要包括四大类技术体系：胚胎移植相关技术；动物克隆技术；胚胎干细胞技术；转基因动物技术等。一、胚胎移植相关技术（一）胚胎移植胚胎移植（embryotransfer）是一项难度较高的显微操作过程，是胚胎工程的重要基础。根据胚胎发育阶段不同，胚胎移植可分为输卵管移植和子宫移植。原核胚胎到桑葚胚期的胚胎进行输卵管移植，囊胚期后的胚胎进行子宫移植。按照操作方法,胚胎移植又可分为手术法和非手术法。小型实验动物常采用手术法，大动

2、物常采用非手术法。（二）排卵控制排卵控制是通过对雌性动物采用外源激素处理，改变其性周期和排卵数来实现的。目前常用到的激素有促卵泡激素（FSH），促黄体激素（LH），孕马血清促性腺激素（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG）。其中FSH的生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟并分泌雌激素；LH也称促间质细胞激素（ICSH），其生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素；PMSG可以促进雌性动物卵泡的发育、排卵及黄体的形成；HCG也可促进卵泡发育和排卵。实际应用中，常把FSH和LH，HCG和PMSG配合使用，可取得较好效果。(三)体外受精和显微受精体外受

3、精（invitrofertilization，IVF）是成熟卵细胞与经过处理的精子在体外结合而发育成合子的过程。体外受精的合子经过体外或者异种动物体内培养，再移到同种动物体内妊娠产子，由此得到的动物称为试管动物。体外受精所用的精子在大、中型动物可采用人工按摩或电刺激法获得,小型动物需用手术法从附睾获得。卵子来源有两种方法,小型动物系采用超数排卵处理,从输卵管采集体内成熟卵子;或采用手术方法,从卵巢上采集未成熟卵子进行体外成熟。牛、羊等大、中型动物可进行活体采卵或从屠宰后动物的卵巢获得。制约体外受精技术发展的主要因素有：在体外培养的卵母细胞的细胞质是否真正成熟不仅影响到受精

4、，而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响，应在培养条件上进行研究；多精子受精难以控制，导致正常发育率低，可通过调整精子浓度或受精时间来控制；体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时会发生退行性变化，即发育阻滞(block)。显微受精（microfertilization）技术是通过对动物配子进行显微操作以使其受精的技术。它是在体外受精的基础上，随着显微操作技术和设备的不断发展和完善而出现的。这一技术目前有透明带下注射、透明带钻孔、透明带部分切口和卵细胞质内注射等方法。（四）胚胎培养胚胎培养（embryoculture）是指在人工创造的类似于体内条件的环境中，对获取的

5、早期胚胎进行体外培养，以便观察其发育或人工干预某一发育过程的技术。目前胚胎培养一般有两种方法。一种是共培养系统，这种系统首先要求在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。另一种是简单化学限定培养法。相对而言，简单化学限定培养法使用方便、培养液配制简单，而且成分明确便于研究特定物质对胚胎发育影响的特点，因此在早期胚胎体外培养中得到广泛使用。（五）胚胎保存胚胎保存（embryopreservation）是指应用超低温冷冻技术将胚胎保存起来而不丧失活力。1971年，whittingham首次报道冷冻小鼠胚胎获得成

6、功。随后，对大鼠、兔胚胎的冷冻保存也取得了成功。到目前为止，已有十多种哺乳动物胚胎冷冻获得成功。超低温长期保存胚胎对生命科学的发展具有重要实际意义。冷冻保存实验动物胚胎的方法有多种，主要有常规冷冻法、玻璃化冷冻法等。一般包括抗冻保护剂的添加、植冰和降温、胚胎解冻、抗冻保护剂的去除等步骤。常规冷冻法是将经冷冻保护剂处理的胚胎以较慢速度（1℃/分钟）降温至-7℃，平衡10分钟后，在此温度诱发结晶，再平衡10分钟，以0.1—0.3℃/分钟的速度降温至-36℃以下，投入液氮中保存。按这种方法冻存的胚胎解冻时需要慢速升温。脱去冷冻保护剂的浓度方向与冷冻时相反，按相同浓度梯度，从高浓

7、度向低浓度进行。常规冷冻法的优点是细胞脱水完全，细胞内不易形成冰晶；缺点是很费时，冷冻保护剂处理胚胎的时间过长，同时设备昂贵，花费高。玻璃化冷冻法（vitrification）是Rall和Fahy于1985年建立的一种快速，简捷有效的超低温冷冻方法。这种方法采用的高浓度冷冻保护剂组成的玻璃化液(渗透和非渗透性保护剂相结合)，在低温下变粘稠，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式。玻璃化液中主要的冷冻保护剂是二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）和乙二醇（ethyl