《转基因动物技术》PPT课件

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1、TransgenicTechnologyDefinitionTransgenictechnologyreferstothegeneticengineeringofanorganismsothatitsgenomicDNAisalteredtoover-orunderexpresscertaingenes.TransgenictechniqueGeneKnockOutGeneKnockInGeneKnockDownGeneTrappingmouse,rabbit,rat,sheep,pig,cawetc.The2007NobelPrizeinphysiologyormed

2、icineisawardedfortheirdiscoveriesofprinciplesforintroducingspecificgenemodificationsinmicebytheuseofembryonicstemcells.OliverSmithiesMartinJ.EvansMarioR.CapecchiEvans’swork:TheEScellsStemcellMartintalksabouthisworkembryonicstemcell，ESsomaticstemcellMarioCapecchiandOliverSmithies,independ

3、entlyofeachother,discoveredhowhomologousrecombinationbetweensegmentsofDNAmoleculescanbeusedtotargetgenesinthemammaliangenomeanddevelopedmethodstogenerategeneticallymodifiedmice.转基因小鼠构建过程构建打靶载体ES细胞打靶和筛选囊胚注射动物杂交筛选北京诺兰信科技北京高校生物技术转化平台http://www.genetargeting.com/25HealthSciencesDriveStonyBro

4、ok,NY11790-3350，USA一、打靶载体定点突变技术STRATAGENE，AgilentTechnologiesInc分子开关--Cre/Loxp系统Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列。可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP之间的DNA同源重组。Loxp位点：[locusofcrossing-over(x)inP1]site:Cre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方

5、向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。两个loxp位点的方向相反CreloxploxpGeneGenepromoterpromoterloxploxpKnock-outgeneKnock-outstopcassetteKnock-outlabelFLP/frt重组系统来自啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)其中重组酶FLP

6、可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的同源重组，实现基因切除的效果。作为“第二分子开关”FLP/frt系统与Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因表达时间控制和组织特异性表达Cre的表达还可以通过在启动子上引入相应某种配体的元件(比如某种药物)而达到时间控制和组织特异性表达。四环素、1型干扰素、三苯氧胺(Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药物诱导型的启动子。LSL-Cre:loxp-stop-loxp,CreFSF-Flpo:FRT-stop-FRT,FlpoEstablishedLungTumorsSi-Bm

7、i-1二、ES细胞打靶和筛选HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因HSV－tk基因的产物使细胞能利用培养基中的GANC(Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZV-TK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质araATP，杀死肝癌细胞。Neo基因卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡