工程菌的高效表达和稳定性

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1、工程菌的高效表达和稳定性工程菌简介用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。工程菌的高效表达基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质产品。表达系统有原核系统和真核系统。原核生物基因表达的特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核的启动子，催化所有RNA合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的，二

2、者也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环型DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质。每个核糖体可独立完成一条链的合成，多核糖体可同时在1条mRNA合成多条肽链，大大提高了翻译效率。（4）原核基因不含内含子（intron），没有转录后加工过程。（5）原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子控制）和终止控制（衰减子控制）。（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3‘末端碱基互补的序列，即

3、SD序列，真核基因则无此序列。外源基因在原核中表达的关键：（1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；（2）外源基因不能带有intron；（3）利用原核细胞的强启动子和SD序列等控制外源基因的表达；（4）外援基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；（5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主菌的毒害。外源基因在真核细胞中的表达哺乳动物细胞做宿主表达体系的优点：（1）能识别和除去外源基因中的内含子，剪切加工成成熟的mRNA；（2）表达的

4、蛋白质在翻译后被加工的机会多（如糖基化），更接近于体内构型；（3）易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性；（4）经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。影响工程菌发酵的原因对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响；接种量的影响；温度的影响；溶解氧的影响；诱导时机的影响；诱导表达程序的影响；pH的影响。1.培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，从而使外源基因高效表达。2.接种量的影响接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体

5、延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达；接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因；接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。3.温度的影响温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。4.溶解氧的影响对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的

6、参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。发酵时，随溶解氧浓度的下降，细胞生长减慢，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的溶解氧值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。5.pH的影响根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，培养后期重点是优化外源蛋白的

7、表达条件。6.诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。在对数生长期，细胞快速繁殖，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。7.诱导表达程序的影响热诱导的程序提高外源蛋白表达量。基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定结构不稳定分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变导致质粒不稳定的常见的三个因素：1.含质粒菌产

8、生不含质粒子代菌的频率；2.这两种菌比数率差异的大小;3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构。对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳