关于基因工程菌的稳定性

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1、关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢

2、失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。1常见分裂不稳定的两个因素：1.1含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2这两种菌比数率差异的大小。2提高质粒稳定性的方法2.1选择合适的宿主菌；2.2选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3加入选择性压力；2.4采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。有些含质粒菌对发

3、酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。2.5控制工程菌的培养条件；2.6采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定

4、。这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。质粒的稳定性与宿主及载体的特性有关,也与培养条件有密切的关系。通过优化培养条件以提高质粒稳定性正是工程人员要做的工作。很多学者已从不同方面探讨了提高质粒稳定性的方法，但实施起来均存在一定困难。1988年Weber等尝试在基因工程大肠杆菌的培养中采用周期操作方式,从一定程度上提高了质粒的稳定性。由于该方法简单易行,这方面的研究已引起国内外学者的广泛关注。本文以基因工程酵母菌为例,初步探讨振荡式操作方式对基因工程菌质粒稳定性的影响,为进一步开发非线性调控技术奠定基础。重组DNA技术可以提供具有

5、极强选择性和累积目的代谢物能力的菌株，但为了进一步降低这些代谢物的生产成本，还需建立高效的生物转化体系及优化重组菌的培养环境以期获得最佳表达。虽然“基因型加上环境等于表现型”，但微生物的环境控制经常被人们忽视或缺少认识。事实上，重组菌的最佳培养条件通常是与环境控制紧密相联的，因为微生物对环境理化性质的微小变化都十分敏感。工程菌生物反应器的反应性很大程度上受非转化细胞繁殖程度的影响。这种现象在中试及工业生产水平上也存在并使得重组菌的应用大受限制。连续培养及批式培养中出现的非转化子(P-)均是由转化细胞(P＋)-3-退行而来的。可

6、能缘于两种机制：分离不稳定性和结构不稳定性。前者源于一个不同细胞间质粒DNA分离的不完全系统；后者则是因质粒结构改变而引起。这些改变包括在质粒DNA上的缺失、插入和重排。由此而产生的P-细胞则不具备产生目的代谢物的能力，而P＋细胞因需合成更多的DNA、mRNA及蛋白而在生长上滞后于P-细胞。同时它们还必须与染色体基因竞争合成目的物所需的前体(如核苷酸、氨基酸等)，而且P＋细胞的生长还依赖于质粒的数目、大小和蛋白产物的毒性等。所以，一旦在反应体系中产生P-细胞，就会导致体系中具有不同特性的P＋、P-细胞共存，进而使反应后期几乎不

7、再有什么收益。由于重组子的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，所以可以通过基因水平的控制和限制反应器中P-细胞的繁殖来加以提高。据此，Ensley提出了“选择性和非选择性”的概念。“选择性”包括：1)在反应器中保持抗生素压力；2)通过质粒进行营养缺陷型互补；3)噬菌体抑制及4)转化子中自杀蛋白的表达。而“非选择性”方法包括：1)引入分离位点而使子细胞在分化过程中获得好的分离；2)插入一段生长基因及3)培养条件的控制。而质粒的稳定性不受培养过程中是否通氧影响。另外人们还采取了将菌体繁殖与产品转化分开两步进行的措施。尽管进行了诸多

8、优化生物反应器的尝试，但在工业规模的生产中均未获得成功。人们发现如将基因工程及酶工程相结合则大规模培养过程中重组菌的稳定性问题可能会得到较好的解决。最近已有一些固定化基因工程菌用于生产的报道，与传统培养方法相比，已显示出了一定的优势，如在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度；克隆产