基因工程菌稳定性分析.ppt

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1、基因工程菌稳定性分析基因工程菌稳定性分析第一节基因工程菌的概述第二节质粒载体不稳定现象及类型第三节提高质粒稳定性的方法第四节影响质粒载体稳定性的主要因素第五节对NHase重组质粒稳定性分析2第一节基因工程菌的概述一、基因工程菌的定义基因工程菌(GeneEngineeringBacteria)是利用基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其表达所需蛋白的重组菌。二、基因工程菌构建的基本路线目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体导入受体菌-筛选导入成功的受体菌第一节基因工程菌的概述三、质粒的稳定性问题基因工程技术是生物技术的核心和关键，

2、通过载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技术工业化的瓶颈。第二节质粒载体不稳定现象及类型一、质粒载体不稳定的现象：克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性；可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加；产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体；结构重排导致无法正常表达的突变体。第二节质粒载体不稳定现象及类型二、质粒载体不稳定性的类型结构不稳定指结构(序列)不稳

3、定性,即重组质粒上某一区域的DNA序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象,导致其表观生物学功能的丧失;分离不稳定指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。第二节质粒载体不稳定现象及类型1.结构不稳定原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。共同特征：同向重复序列之间的同源重组（shortdirectrepeat).例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1

4、因子的插入效应，结果产生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。第二节质粒载体不稳定现象及类型2.分离不稳定原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的质粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。第二节质粒载体不稳定现象及类型三、质粒拷贝分配到子细胞的途径质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配和随机分配两种不同的方式。1主动分配的方式有两种:平均分配--每个

5、子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机分配第二节质粒载体不稳定现象及类型由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。第二节质粒载体不稳定现象及类型2随机分配在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配。第三节影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应第三节影响质粒载体稳定性的主要因素1.新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲

6、线。即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。第三节影响质粒载体稳定性的主要因素2.拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平均值数决定的。差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定的原因之一。第三节影响质粒载体稳定性的主要因素具有低差度分布特性的质粒载体相当的稳定性，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性

7、较差。位于后者的这种分布的低拷贝数的一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。第三节影响质粒载体稳定性的主要因素3.寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入片段大小存在相关性。决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含质粒寡聚体细胞生长速率。第三节影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。实验观察表明，

8、在重组缺陷(rec-)的大肠杆菌寄主细胞中，基因工程常用载体pBR322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性就相应的下降。第三节