qPCR原理及应用

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1、实时荧光定量PCR的原理和应用2010.10雅睿生物黄宝福目录•实时荧光定量PCR原理PCR荧光标记绝对定量和相对定量•实时荧光定量PCR应用•实时荧光定量PCR发展digitalPCR,qPCRArray实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerasechainreaction(PCR)1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。聚合酶链式反应Polymerasechainreaction(PCR)1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟

2、细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCRDNA5’3’解旋解链ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC结合引物TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG子链延长3’5’PCR5’3’DNAATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋解链D

3、NAGGAUCG3’聚合酶5‘结合引物5‘DNA3’AUCGCG聚合酶子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’PCR5’3’DNAATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC解旋解链TAGCGCTATCGCATCGACGCTDNAGGAUCG3’聚合酶5‘结合引物5‘DNA3’AUCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC聚合酶子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’PCR原理123高温变性低温退火适温延伸重复1~3步25~30轮温度94形成DNA目的DNA片段722条单链变性扩增100万倍以上（℃）子链延伸DNA

4、加倍55DNA单链与引物复性22DNA双螺旋12345时间（min）模板DNA第四轮扩增第五轮扩增第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术：实时荧光定量PCR技术：对PCR扩增反应的终点产利用荧光信号的变化实物进行定量和定性分析。无时检测PCR扩增反应中每一个法对起始模板准确定量，无循环扩增产物量的变化，通法对扩增反应实时检测。过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过

5、程，无需后处理即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)valueCt值的重现性纵轴：荧光信号量横轴：PCR反映循环数Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理•理想的PCR反应：•X=X*2n0•非理想的PCR反应：•X=X(1+Ex)n0•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•

6、X0：初始模板量•Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时:X=X(1+Ex)Ct=M(1)Ct0X:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.Ct在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX(1+Ex)Ct(2)0整理方程式(2)得:lgX=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)0Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理StandardCurve40393837363534333231302928272625C(t)Value242322

7、21201918171615110100100010000100000100000010000000CopyNumbers模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-相对定量靶核酸：X=X(1+E)Ct,x=KCt0xx参比内标：R=R(1+E)Ct