qPCR原理与分析方法

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1、―qPCR系统从RNA提取到荧光定量内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介实时定量PCR技术的概念实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时荧光定量PCR技术涉及的概念扩增曲线荧光阈值Ct值扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光

2、强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件扩增曲线荧光信号的域值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值荧光域值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt

3、值横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性Ct值定量数学原理理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数Ct值定量数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率Ct值定量数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，

4、它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）CyclenumberFlourescencCk104Ck102SampleCyclenumberLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系Ct值定量数学原理LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）mRNA表达的研究：如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析DNA拷贝数的定量：如易位基因的检测单核苷

5、酸多态性（SNPs）分析基因型分析：杂合或纯合子临床检测：病毒感染的定量监测实时荧光定量PCR技术的应用内容概要实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法绝对定量分析方法简介相对定量分析方法简介非特异性荧光标记：1.SYBRGreen特异性荧光标记：2.TaqMan3.MolecularBeacon常用荧光标记方法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与

6、Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan方法TaqMan探针工作原理标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂分子信标(MolecularBeacon)SYBRGreen法反应示意图SYBRGreenSYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光SYBRGreen法SYBRGreen结合到DNA小沟部位示意图几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研

7、中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物SYBRGreen法的应用Sample25定量的方法Log（起始浓度）与

8、循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线—分析产物的特异性融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物融解曲线分析SYBR法实验流程及注意事