QPCR基本原理及其应用

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1、/'QPCR原理及应用由于Real-timeqPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-timeqPCR所代替。由于real-timeaPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测，很多没有做过real-timeqPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从real-timeqPCR的发展史说起，包括real-timeqPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个

2、方面了解real-timeqPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-timeqPCR发展史Real-timeqPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-timeqPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在Real-timeqPCR技术的发展过程中，定量

3、PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycleriQ5@、MyiQ@、MJResearchChromo4TMOpticon系列；Stratagen

4、eMxTM系列；RocheLightCycler@系列；EppendorfMasercycler@；CorbettRotor-GeneTM；CepheidSmartCycler@和BIOER的LineGene系列。/'随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-timePCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二、Real-timeqPCR概述1.Real-timeqPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一

5、般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。

6、具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。2.Real-timeqPCR的数学原理首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数Ct值（Ctvalue），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程：/'  /' 从线性方程上看，斜率（slope）为-1

7、/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。3.Real-timeqPCR的种类根据real-timeqPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR@GreenI或者特殊设计的引

8、物(如LUX@Primers)通过荧光染料来指示产物的增加。3.1Taqman@探针法/'Taqman@探针是最早用于定量