分子量(还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程

《分子量(还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、细胞因子分子量（还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。范围：适用于细胞因子蛋白质分子量测定。目的：测定待检品分子量是否符合《中华人民共和国药典》2005年版要求原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。其催化系统为过硫酸铵-TEMED系统。而SDS这种阴离子表面活性剂的加入，它能使蛋白质氢键、疏水键打开，并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物，其负电荷远远

2、超过了蛋白质原有的电荷，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素，从而达到分离不同组分的蛋白质的目的，并在还原剂巯基乙醇的存在下，（定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原；以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去，使蛋白质具有相同的构象），可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。内容：1材料1．1样品：经二人复核批号无误后检测1．2试剂甲醇CH3OH分析纯无水乙醇C2H5OH分析纯浓盐酸HCl分析纯甘油C3H8O3分析纯硝酸银AgNO3分析纯重铬酸钾K2Cr

3、2O7分析纯正丁醇C4H9OH分析纯甲醛HCHO分析纯丙烯酰胺CH2CHCONH2分析纯甲叉双丙烯酰胺[（CH2CHCONH2）2]CH2分析纯过硫酸铵（NH4）2S2O8分析纯TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2分析纯甘氨酸C2H5NO2分析纯SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa分析纯乙酸CH3COOH分析纯碳酸钠Na2CO3分析纯β-巯基乙醇HSCH2CH2OH分析纯溴酚蓝C19H10Br4O5S分析纯1．3分子量标准品：法玛西亚公司。1．4注射用水：符合《中华人民

4、共和国药典》2005年版要求1．5设备扭力天平上海第二天平仪器厂垂直板状电泳槽北京东方仪器厂恒温恒流电泳仪法玛西亚公司快速电泳槽BIORADUSA全自动扫描仪CS-930日本岛津TS-1型摇床1．6器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管、3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。2方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。2．1．2调试仪器设备2．1．2．1恒温恒流电泳仪工作状

5、态良好，已经挂“备用”标志牌。2．1．2．2全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用”标志牌。2．1．2．3扭力天平工作状态良好，已挂“备用”标志牌。2．1．3摘下扭力天平“备用”标志牌，挂“运行”标志牌。2．1．4配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。2．1．4．1聚丙烯酰胺凝胶母液100ml用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、

6、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。一般不超过1～2个月。2．1．4．2分离胶缓冲液100ml用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。2．1．4．3浓缩胶缓冲液100ml用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液

7、的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。2．1．4．41%SDS50ml用扭力天平准确称取SDS0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。2．1．4．51%TEMED50ml用吸管准确吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。2．1．4．61%过硫酸铵50ml用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标

8、明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。2．1．4．7电极缓冲液3000ml用扭力天平准确称取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。2．1．4．8固定液500ml用量筒准确量取甲醇250ml，乙酸50ml，补加注射用水至500m