SDS-PAGE标准操作规程

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1、SDS-PAGE标准操作规程一、试剂（一）储存液(1)2MTris-HCl(pH8.8)，100ml称取24.2gTris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH8.8(约加4ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml。(2)1MTris-HCl(pH6.8)，100ml称取12.1gTris碱；加50ml蒸馏水；缓慢的加浓盐酸至pH6.8(约加8ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高；加蒸馏水至100ml。(3)10%(w/v)SDS，100ml。室温保存称取10g的SDS；加蒸馏水至总量为100ml。(4)50%(v/v)甘油，100ml倒取50ml100%的甘油；加入

2、50ml蒸馏水。(5)1%(w/v)溴酚蓝，10ml称取100mg溴酚蓝；加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。（二）工作液(1)30%(w/v)丙烯酰胺/0.8%(w/v)双丙烯酰胺30g丙烯酰胺0.8g双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45μm滤膜。可在4℃存放数月。(2)4×Tris-Cl/SDS(pH8.81.5MTris-ClContaining0.4%SDS)91gTrisbase2gSDS加水300ml，用1NHCl调pH至8.8，再加水至50

3、0ml过0.45μm滤膜，4℃存放(1)4×Tris-Cl/SDS(pH6.80.5MTris-ClContaining0.4%SDS)6.05gTrisbase0.4gSDS加水40ml，用1NHCl调pH至6.8，再加水至100ml过0.45μm滤膜，4℃存放(2)10%过硫酸铵APS0.1g过硫酸铵1ml蒸馏水长期不用应-20℃干燥分装保存，临用前再加D.W。(3)5×电泳缓冲液15.1gTris碱72.0g甘氨酸5.0gSDS加蒸馏水至1L，pH应该在8.3左右。(4)5×样品缓冲液，10ml0.6ml1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)60mmol/L5ml50%的甘油25%

4、2ml10%的SDS2%0.5ml2-巯基乙醇14.4mmol/L1ml1%溴酚蓝0.1%0.9ml的蒸馏水可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。(5)考马斯亮兰染色液1.0gR-250450ml甲醇450mlD.W100ml冰醋酸(6)脱色液100ml甲醇100ml冰醋酸800mlD.W(7)一、步骤1.准备　先将电泳玻璃平板洗干净，用95%乙醇擦净，晾干，固定于平板固定架上。（注意：①高低板方向正确，底面要平，必要时可用凡士林封底；②玻璃平板固定高低时四个螺丝应依次适当旋紧，再装于固定器架）2.制胶按如下顺序配制和添加试剂stackinggelseparatinggelT=4%C=2.6

5、%10%12%13%D.W6.17ml4.17ml3.5ml3.17ml30%Acry/0.8%Bis1.33ml3.33ml4.0ml4.33ml4×Tris-Cl/SDS(pH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml4×Tris-Cl/SDS(pH6.8)2.5mlTemed5～7µl(一般6)5～7µl7.5µlAp(10%)50～70µl(一般60)50～70µl75µl注意：配胶时勿搅起气泡，先配好其它成分，在灌胶前用枪头分别吸好适量TEMED和AP后，再先加TEMED摇匀，后加AP，摇匀后灌胶。1.灌胶①插入梳子使梳子凹孔略低于低的平板，略低于梳子底沿处划好高度线，拿去梳子，Sepe

6、ratinggel从一固定位置（中部）快速倒入平板内至划线处，再吸取约1mlD.W缓缓注在Seperatinggel面上（起压平胶面作用），静置约50mins待胶凝结；②倒出D.W，亦可再用滤纸小心地将残余水分吸干，插入梳子，沿一侧缓缓注入适量的Stackinggel（勿产生气泡），静置约20mins（其间可加入少量SDS电泳buffer防止蒸干）；③移去梳子出现几个样品槽，用电泳buffer冲洗样品槽2遍。2.平板等装入电泳槽，加入电泳buffer淹没低板3.加样　将样品用适量的样品buffer稀释后煮沸三分钟，再小心地将样品加入电泳凝胶槽中，加样时不能用气泡。上样量要根据凝胶槽大小而定，过

7、多会溢出到相邻孔而影响结果。4.走胶（约45mins-1hr）先低电压70V20mA，待样品进入分离胶后再调高电压约140V40mA直至指示色带到达平板底端，停止电泳关闭电源。5.染色脱色　倒去电泳buffer，自来水冲洗，取下凝胶，用考马斯亮兰染色，染色5-10min，脱色1hr左右。二、注意事项1.检查电极不要插反，开始电泳后要观察电极丝附近是否有气泡冒出，从而确认电流正常。2.过硫酸铵最好现