《文库的构建小结》PPT课件

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1、基因文库（Genelibrary）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。即Genomiclibrary第五章DNA文库的构建DNAlibraries1976年L.ClarkJ.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比

2、值cDNA文库:若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库一、cDNA克隆用的mRNA1.mRNA的完整性第二节cDNA文库的构建基因特异性器官特异性不均匀性mRNA的大小500bp～8kb大部分1.5～2kb2．mRNA的丰度常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，1

3、0—15%tRNA高丰度mRNA珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白在特定细胞中占50-90%低丰度mRNA0.5%被称为低丰度或稀有mRNA文库应足够大，鉴定和分离困难反转录酶AMV(42℃)M-MuLV(37℃)RNaseHRNaseH弱长mRNA引物oligo(dT)12-18一般要求浓度高模板氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构RNase抑制剂AAAAAAAmRNA5'3'TTTTTTTT二、cDNA第一链的合成cDNA1．自身引导法三、cDNA第二链的合成NaOH处理需用S1酶2.置换合成法RNaseH,

4、Coli.DNApoly.1,lingase有效无须进一步纯化不需用S1酶，否则会导致cDNA酶的大量损失问题：如何脱帽以便进入载体5’端cDNA不能合成（少几个Nt）有可能仍形成发夹结构3.第二链引导合成Okayama-Berg方法4.引物-衔接头合成法四、dscDNA的分子克隆1.同聚物加尾问题：只对质粒有效，文库不易保存和复制。尾的长短不一(100dA/dT,20dG/dC)同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。2．合成接头和衔接头cDNA合成接头(含酶切位点)酶切N

5、otI,SalI与载体连接Optional:methylation接头中含稀有位点，如NotI,SalI(100kb一次)先甲基化dscDNA，再连接接头用衔接头替换接头接头中含稀有位点，如NotI,SalI(100kb一次)先甲基化dscDNA，再连接接头用衔接头替换接头3.其他方法mRNA-cDNA杂交体克隆依次连加不同接头其他与cDNA第二链合成有关的方法，如Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法3.其他方法(1)mRNA-cDNA杂交体克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA末端加尾效率只

6、及DNA的1/10合成第一链后,加尾,与带dT尾的载体退火,在宿主体内,可除去RNA,代之以DNA优点:无须合成第二链,序列完整但效率<1/10(2)RACErandomamplificationofcDNAendscDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆筛选文库是一般只能针对一个或几个cDNA克隆，而RACE可产生大量独立克隆mRNAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAA1.经典RACE3‘末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反转录QOPCRGSP1QIGSP2根据

7、已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法获得3‘末端和5’末端的序列5‘末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2-TTTTTTQ1/GSP1PCR反转录Q2/GSP2PCRGSP2获得的cDNA克隆片段AAAAAAAGSP1反转录连接RNA寡聚物NNNNNNNN2.新RACE第三节基因克隆的策略基因克隆的本质从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”常见筛选工具:探针狭义:核酸,抗体广义:还包括其他筛选手段抗性基因:a

8、ntibiotics抗性基因,抗重金属活性一、功能筛选分解基因:苯环化合物,分解酶功能活性：杀虫，酶启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选AmporiMCSTetgenewithoutpromoter功能缺失在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变如营养缺陷型相关的基因二、核酸探针同源DNA探针高度保守的基因rRNA基因邻近种属的相应基因相应基因的序列比较合