实验8-酶的分离纯化

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1、主讲教师：王丹生物技术实验室酶化学酶的概念：酶是生物催化剂，是活细胞合成的具有高度催化效率和高度特异性的一类蛋白质。知识回顾酶促反应的特点它遵守一般催化剂的共同性质：1.在化学反应前后都没有质和量的改变；2.只能促进热力学上允许进行的反应；3.只能加速可逆反应的速率，而不能改变反应的平衡点，即不改变反应的平衡常数。4.酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速率加快。酶不同于一般催化剂的特点：（一）酶的催化效率极高通常比非催化反应高108～1012倍；比一般催化剂高107～1013倍。催化剂每摩尔需活化能无18000J胶态钯11700J过氧化氢酶2000J过氧化氢分解反应

2、所需活化能催化剂每摩尔需活化能无18000J胶态钯11700J过氧化氢酶2000J（二）酶具有高度特异性1．绝对特异性：有的酶只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应生成特定结构的产物，称之为绝对特异性（absolutespecificity）。2．相对特异性：大多数酶作用于一类化合物或一种化学键，这种不太严格的选择性称为相对特异性（relativespecificity）。绝对特异性相对特异性图5-9蔗糖酶的水解作用3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异性（stereospec

3、ificity）。图5-11乳酸脱氢酶的立体异构特异性主要内容单底物酶处反应动力学酶的分离纯化单底物酶促反应动力学酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种因素对酶促反应速度的影响。酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学研究中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如，要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种因素的影响进行研究。酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。各种因素对酶反应速度的影响2、底物浓度3、pH（最适pH的概念）4、温度（最适温度的概念）5

4、、激活剂6、抑制剂1、酶浓度当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E]第一节动力学方程推导酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmax[S]/(Km+[S])单分子酶促反应的米氏方程及Km推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。米氏方程:米氏常数

5、:米氏方程的推导令：将（4）代入（3），则：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由[ES]决定，即，所以(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于恒态时：当[Et]=[ES]时，(4)所以酶反应速度与底物浓度的关系曲线当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比。[S]VVmax目录随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速。[S]VVmax目录当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度。[S]VVmax目录第二节实验数据的处理—分析酶促反应速度的作图法一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)将实验所得的一些初

6、速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]，将1/v对1/[S]作图，得一直线。该直线纵截距＝1/Vmax，斜率＝Km/Vmax，横截距＝-1/Km。应用双倒数作图法处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便，也是最广泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，实验时必须注意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。1.下图是根据[S]在0.33～2.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线基本上是水平

7、的。这种情况虽可测得1/Vmax，但由于直线斜率近乎零，-1/Km则难以测得。[S]在3.3～20Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。3.如果[S]比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。[S]在0.033～0.2Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程：3.Eadie-Scatchar