实验四淀粉酶的初步分离纯化

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1、实验四淀粉酶的初步分离纯化一、目的和要求1.掌握盐析法初步分离纯化蛋內质的原理和方法；2.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。3.掌握膜分离原理和方法二、基本原理1.蛋白质的盐析蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷）维持胶体的稳定性。由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类［如（NH^SO^Na2S0,、NaCl或MgSO,等］时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增

2、大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高面增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集面沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合

3、的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。2.透析脱盐的原理蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1〜lOOrw）内，不能透过半透膜。选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的W端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。这种方法可除去和蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质，

4、是常用来纯化蛋白质的方法。透析需耍较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。三、试验材料1.培养基种子培养基：牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g葡萄糖1.5g/1000mlH20配100ml发酵培养基：牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g/1000ml2.酶活测定溶液0.2mol/LpH6.8PBS缓冲液葡萄糖标准液lmg/mLDNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）3.试剂蛋白胨、牛肉、可溶性淀粉、（NH4）2SO4、NaOH、HCI、、Na2HPO

5、4*12H2O、NaH2PO4*H2O、EDTA4.仪器或其它用具微量移液器、移液器枪头、透析袋、恒温培养箱、摇床、紫外检测仪（分光光度计）、离心机、分析天平、pH计、量筒、250ml瓶、分装架、记号笔、纱布、酒精灯、灭菌锅、干燥箱、恒温水浴锅等；四、试验路线发酵培养一粗酶液制备->硫酸铵盐析一透析脱盐浓缩一浓缩酶液酶活测定五、操作步骤1.菌株发酵将实验一屮纯化的菌株接入种子培养棊摇瓶培养24h，2%的接种量接种到发酵培养基，37°C,180r/min,培养36h;2.粗酶液的制备发酵液在8000r/min

6、离心20min,收集上清液即为粗酶液，测定酶活方法参见实验三DNS测淀粉酶活力。3.硫酸铵盐析3.1盐析条件的确定40%、60%和80%盐析步骤1）发酵液上清分装至3支烧杯中，每个20ml;2）加硫酸铵至3支烧杯中，对照25"C硫酸铵饱和度配置表，使其饱和度分别为40%、60%和80%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的轻柔搅拌（否则局部浓度过高会使酶失活）使硫酸铵完全溶解；3）室温静置2h,出现白色沉淀4）离心，分别取沉淀用少量0.2mol/LpH6.8PBS缓冲液回溶。1.透析脱盐浓缩4.1透析膜前处

7、理透析袋的预处理方法：1）将透析袋剪成合适的长度：2）在一只250mL的玻璃烧杯中，加入200mL的透析袋处理液，微波炉中预执.3）将透析俊装入其中，电炉上煮沸10min；4）用蒸馏水彻底洗涤；5）蒸榴水中煮10min；6）冷却后4°C存放，存放过程中透析袋应完全放入0.02nx）l/L磷酸酸缓冲液（pH7.0）中7用细线扎紧透析袋一端，注入清水检验不漏后加入不超过透析袋体积1/2的须透析溶液。4.2橾作1沉淀用少量0.2mol/LpH6.8PBS缓冲液回溶，移入透析袋中，经透析膜袋在20倍量0.02mol

8、/L磷酸缓冲液（pH7.0）中在室温，36h透析脱盐（每过6h换一次透析液）.2取各梯度脱盐沉淀5mlSOOOr/min离心20min,取上清测酶活。（沉淀为变性蛋白质酶活很低。）1.酶活力的测定参照实验三中的酶活测定。粗酶液540nm盐析40%1.221实验数据0.2910.31460%80%2.7081.456七、实验报告1.实验结果（1）测定粗酶液酶活；（取平均值）粗酶液540nm0.2910.314酶活力