实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化.doc

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1、实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化一、目的和要求1.掌握常用培养基的配制方法。2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。二、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合

2、平板法或平板划线分离法等方法分离、纯化出该微生物，直至得到纯菌株。需要注意的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不能保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养需要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，这里生活的微生物在数量和种类上都是极其多样的，因此，土壤中的微生物具有较高的丰富度和多样性，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。本实验将采用平板分离法从土壤中分离出淀粉酶高产的菌。三、试验材料1.样品：草坪采集的新鲜土壤2.培养基2.

3、1平板筛选培养基牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g蒸馏水1000ml，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。2.2斜面培养基牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g蒸馏水1000ml，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。3.溶液和试剂新鲜土壤、蒸馏水、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、1M/LNaOH溶液、1M/LHCl溶液4.仪器或其它用具无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、微量移液器、移液器枪头、恒温培养箱、无菌工作台、天平、吸耳球、pH计、量筒、试管

4、、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分装架、玻璃棒、烧杯、铁丝筐、接种环、酒精灯、牛皮纸、纱布、铁架台、电炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅、冰箱等四、试验路线称取土样→梯度稀释→平板筛选→斜面接种→平板划线分离纯化五、操作步骤1培养基的制备1.1称量按培养基配方依次准确称取各药品，放入适当大小的烧杯中，蛋白胨极易吸潮，称量应迅速；牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。1.2溶化在烧杯中先加入4/5总体积蒸馏水。将药品完成溶解后，倒入锅中加热至煮沸时加入琼脂，边夹边搅拌直到琼脂完全溶解。

5、1.3调Ph根据培养基对pH的要求，用1M/LNaOH或1M/LHC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等,最后补充水到所需总体积。1.4分装过滤后立即用漏斗进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜，固体分装量为管高的1/5，灭菌后制斜面；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。1.5加塞培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。1.6灭菌将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，

6、加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121℃并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间。30min后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至”0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。1.7搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管口端搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。1.8倒平板将灭菌后的培养基，于水浴锅中冷却到55～60℃，立刻倒平板，倒平板的方法是右手持盛培养

7、基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。2淀粉酶