土壤中放线菌的分离和纯化实验

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1、土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。2、掌握培养基的灭菌方法。掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、洒精棉球、镊子、电子天平、称景纸、烧杯、景筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接

2、种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具右全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。U!1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。2、

3、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4°C保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量简或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9g、蔗糖30g，放入1000mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用

4、玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000mL,搅拌均匀。需要注意的是，在加热琼脂，制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要秉新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH，一直调到培养基的pH为6（5.8〜

5、6.5）左右为止。培养基的分装溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶（50mL或100mL）中。注意不要让培养基沾到瓶U和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5〜1/4。每1000mL培养基，可分装25〜30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸（每块大小约为9cmX9cm）中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。3、高压灭菌培养基的高压灭菌包括以下儿个步骤。第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金

6、属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装存蒸馏水的锥形瓶、带螺U盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用报纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。第三，灭菌。待需要灭菌的物招码放完平•，盖上锅盖。在98kPa、121°C下，灭菌20min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固后再使用4，、再在操净工上进行消毒，先用紫外线照射30MIN，然后送

7、风，关闭紫外灯，改用口光灯，对手用酒精进行消毒，对培养基表面也要用酒精进行消毒。准备工作好了，就进行接种。并且要在酒精灯旁边进行操作，避免污染。镊子要在双孔灭菌器上进行灭菌。4、接种完成后要整理工作台，并且把培养瓶拿到培养架上进行曰光培养。五、放线菌的提取步骤5、（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。6、（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）①取

8、3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，7、分别将土壤悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的土壤稀释液。六、稀释涂布法分离土壤中放线8、（1）倒平板9、将配制好并且灭菌的高氏一号培养