《基因的克隆与分离》PPT课件

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1、第五章基因的克隆与分离第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第二节　基因组文库的构建与基因分离第三节cDNA文库的构建与筛选第四节　根据差异表达获得目的基因第五节　基因的化学合成一、cDNA末端的快速扩增（RACE）RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3‘端和5’端进行克隆，可获得全的cDNA克隆。（RACE克隆的意义）第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。2、根据核心序

2、列，设计新的引物进行cDNA的3’端和5’端的扩增。3、拼接成cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA一、cDNA末端的快速扩增（RACE）（二）经典RACE克隆原理：3’RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3’引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3’末端序列。5’RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列，利用5’

3、锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5‘末端序列。由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA根据中间核心序列设计出5’特异性引物与3’引物扩增第一链cDNA可得到全长cDNA的3’末端序列5’RACE在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5'末端序列第二节基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，

4、这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。一、基因组文库（genomiclibrary）（2）目前常用的载体二、构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为23kpcosmid载体：容量为45kbYAC：容量为1MbBAC:容

5、量为300kb1、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息3、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目三、基因组文库应满足的条件文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-P)ln(1-L/G)P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）L：克隆fragment的平均大小G：Genome大小N：所需的重组载体数（克隆数）N=4.61×GL例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×1

6、04bp，所需的重组载体数：N=基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍，或更高4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105四、基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌基因组文库2、大片段的制备小孔喷射（10kb）、超声波（300bp）、机械搅拌（8kb）①酶切法：不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。识别4对碱基的内切酶适用于制备1~20kb的DNA

7、片段②物理切割法：1、染色体DNA的分离如：Sau3A与BamHI的酶切末端。p1083、载体的制备内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段左臂可置换区右臂SalIBamHIEcoRIEcoRIBamHISalI20kb14kb9kb4、重组连接左臂插入片段右臂左臂插入片段插入片段右臂5、包装6、重组噬菌体感染大肠杆菌基因组文库五、基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：两步或三步原位杂交法以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。cDNAlibrar

8、ymRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。第三节cDNA文库的构建与筛选（1）以mRNA为材料，适用于RNA病毒（2）文库小，构建容易，筛选简单（3）每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列（4）不含内含子序列，可进行原核表达一、cDNA文库的特点cDNA文