《菌种改良》PPT课件

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1、第四节生产菌种的改良菌种选育改良的目标提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品菌种改良方法诱变育种★★★细胞工程育种★★杂交育种原生质体融合基于代谢调节的育种技术★基因工程育种★蛋白质工程育种组合生物合成育种反向生物工程育种一、诱变育种人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。出发菌株的选择菌悬液的制备前培养诱变变异菌株的分离和筛选（一）诱变育种中需考虑的若干因素选择合适的出发菌株

2、复合诱变剂的使用诱变剂剂量的选择变异菌株的筛选选择合适的出发菌株产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；已经诱变过的菌株。诱变剂物理诱变剂化学诱变剂各种射线，如紫外线、X射线、β射线、γ射线、α射线和超声波等甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸、氮芥等。诱变剂剂量既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。目前处理剂量已从以前采用的死亡率90～99％减低为70～80％。诱变剂的选择主要根据已经成功的经验，与诱变剂本身特点、菌种的种类和出发菌株的遗传背景等有关。各种化学

3、诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.01～0.1M5～10minpH值4.5，1M醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1M磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5M10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1M磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1M磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释羟胺（NH

4、2OH∙HCl）0.1～0.5％数小时或生长过程中诱变大量稀释氯化锂（LiCl）0.3～0.5％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释秋水仙碱（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释变异菌株的筛选一般从菌落形态变异类型着手，发现与产量相关的特征挑取一定数量的典型菌株复筛，确定各种类型与产量的关系（二）筛选方法平皿快速检测法形态变异的利用高通量筛选将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器加样，培养后，用计算机记录结果、分析。特定的模型筛选基质金属蛋白酶抑制剂巨噬细胞泡沫化抑制剂HIV-1整合酶抑制剂HIV-1蛋白酶抑制剂蛋白酪氨酸磷酸酯酶P

5、TP1B抑制剂Caspase-3抑制剂HsMetAP1抑制剂Caspase-7抑制剂PTPLAR抑制剂A549，LoVo肿瘤细胞筛选模型（三）新诱变因子及诱变技术低能离子束诱变通常采用N+、H+和Ar+，相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变由于能量沉积引起机体损伤，或遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变产生光、热、压力、电磁效应，引起DNA或RNA改变原生质体诱变（二）细胞工程育种杂交育种指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。原生质体育种1.标记菌株的筛选供融合用的两个亲株要求性

6、能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。营养缺陷型的筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法影印接种法等。（三）基于代谢调节的育种技术通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的生产或切断支路代谢途径、提高细胞膜的透性，使代谢流向

7、目的产物积累的方向进行。组成型突变株的选育限量诱导物恒化培养循环培养抗分解调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育流加葡萄糖、应用混合碳源等抗反馈调节突变株的选育细胞膜透性突变株的选育溶菌酶敏感型例如谷氨酸发酵中采用生物素（VH）缺陷型菌株VH是乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成细胞膜脂肪酸乙酰CoA羧化酶乙酰CoAα-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸VH透过（四）基因工程育种体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。它