菌种复苏课件.ppt

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1、菌种的复苏菌种的复苏、传代、保藏及管理抗生素检验科李淑花简述菌种的纯度与活力的强弱对于微生物测定来说是至关重要的一个环节，为提高菌种的质量，现将菌种的复苏和鉴定方法，接种和保存方法，规范菌悬液的制备，和常用菌种保藏管理以及所用器械和材料等简单的给大家描述一下，以避免操作失误引入的实验偏差。一、仪器和工具培养箱阳性对照室：菌种传代应有单独的操作间，并应有独立的净化空气系统恒温培养箱电热干燥箱菌种保存箱吸管试管接种环高压灭菌锅二、材料和试剂培养基营养琼脂培养基（NA）营养肉汤培养基（NB）菌种保存培养基

2、（SS）菌种的购买和接收冻干菌应为中国兽医药品监察所购买的标准菌种。培养基配制培养基配置1.营养肉汤培养基称取18.0g营养肉汤干粉培养基溶于1000ml纯化水中，加热溶解,分装于10ml试管，每管5ml,经121℃15分钟备用。2.营养琼脂培养基称取33.0g营养琼脂干粉培养基溶于1000ml纯化水中，加热溶解后,分装于试管中，每管约10ml，经121℃15分钟后制成斜面备用。3菌种保存培养基称取24.5g菌种保存干粉培养基溶于1000ml纯化水中，加热溶解后,分装于试管中，每管约10ml，经12

3、1℃15分钟后制成斜面备用。三、菌种复苏方法1、取冻干菌种，用75%酒精棉消毒菌种管外壁后，用砂轮在安瓿瓶上三分之一处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿瓶，将安瓿掰瓶开。用吸管将营养肉汤培养基0.3ml左右或0.9%生理盐水注入被启开的菌种安瓿中并振荡，使安瓿中的冻干菌种溶解成菌悬液。三、菌种复苏方法2、将上述菌悬液全部吸出，接种到营养琼脂斜面上，一般接种3管斜面，将菌种管和毛细滴管投入消毒液中，或者将菌种管在酒精灯上烧灼至沸腾。将接种后的营养琼脂斜面放置在培养箱中，细菌于35℃～37℃培养18～24h

4、，藤黄菌在25℃～27℃培养24h，次日观察菌种的生长情况，如菌种未生长，应继续培养至72小时。菌种的鉴定用无菌接种环将细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，划线分离出单个菌落。然后在35－37℃下培养2－3天。培养后，先观察其是否具有典型的菌落形态，如菌落特征不明显，应挑选单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，及生化试验。工作菌种传代方法用无菌接种环将冻干菌复活后的培养斜面（1代）直接接种于营养琼脂斜面上或接种到营养琼脂培养基平板上，划线分离出单个菌落（2代或4代）。然后在35－37℃下培养24-48

5、h；同法取真菌和酵母菌培养物到玫瑰红钠培养基平板，并在20－25℃下培养5天；若该类微生物为厌氧菌，则培养条件还应为厌氧条件。工作菌种传代方法挑选纯化平皿上特征典型的纯菌菌落（2代或4代），划线接种于营养琼脂或菌种保存培养基斜面上，至少接种两支，在35℃～37℃培养18～24h（3或5代）。斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔，细菌一般一个月转接一次芽孢菌每二个月转接一次，工作菌种可传代至5代，不超过5代可直接用上一代的工作菌种传下一代工作菌种。操作方法先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种

6、环。再将原有的菌种斜面培养基（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后，应斜持试管呈45°角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。操作方法首先，以右手在火焰旁转动两管的胶塞，以便接种时易于拔取。再以右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。环以上凡接种时可进入试管的部分，也应通过火焰烧灼。烧灼时，应把环置于酒精灯的外焰上，因外

7、焰的浓度比内焰高，容易烧红。使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的胶塞，持住，再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接种环未冷却能烫死细菌。操作方法一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许，取出时接种环不能通过火焰，应从火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时，一般先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔粘至管壁或管口。操作方法当接种完毕，立即

8、将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的胶塞。最后将接种环烧灼灭菌放置原处，再把可能未塞紧的塞子塞紧，即可进行培养。控制传代次数，微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，传代次数越多，突变的几率越大，因此要尽量少传代。工作菌种的编码原则制备的每支工作菌种均应贴上标签，标签内容包括：菌种名称、编号、传代日期、代数。传代和接种后，应填写每株菌种应建立《菌种接收传代记录》。菌种有异常情况或有杂菌生长，则应随时更代，并可在传代中，